សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។កំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានកម្រិតគាំទ្រ CSS ។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ក្នុងពេលនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្របន្ត យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
វិធីសាស្ត្រដាក់ស្លាកជិតអង់ស៊ីមដែលផ្អែកលើអេស្ទ័រសកម្ម ឬរ៉ាឌីកាល់ phenoxy ត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយដើម្បីគូសផែនទីកោសិការង និងអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងកោសិការស់នៅ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ អេធើរដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មគឺមិនសូវមានប្រតិកម្ម ដែលបណ្តាលឱ្យមានកាំស្លាកធំទូលាយ ហើយរ៉ាឌីកាល់ phenoxy ដែលបង្កើតឡើងដោយការព្យាបាល peroxide អាចរំខានដល់ផ្លូវ redox ។នៅទីនេះយើងរាយការណ៍អំពីវិធីសាស្ត្រដែលពឹងផ្អែកទៅលើការបិទស្លាកសញ្ញាជិតៗ (PDPL) ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយការភ្ជាប់ហ្សែននៃប្រូតេអ៊ីន សារធាតុបញ្ចេញពន្លឺរបស់ miniSOG ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលមានចំណាប់អារម្មណ៍។បង្កឡើងដោយពន្លឺពណ៌ខៀវ និងត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយពេលវេលានៃការប៉ះពាល់ អុកស៊ីហ្សែន singlet ត្រូវបានបង្កើត ហើយបន្ទាប់មកបានដោះស្រាយដោយ spatiotemporally ការដាក់ស្លាកសំណល់ histidine ដោយការស៊ើបអង្កេត aniline ត្រូវបានសម្រេច។យើងបង្ហាញពីភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់របស់វា តាមរយៈការធ្វើផែនទីប្រូតេអូមជាក់លាក់នៃសរីរាង្គ។ការប្រៀបធៀបដោយចំហៀងនៃ PDPL ជាមួយ TurboID បង្ហាញពីការគ្របដណ្តប់ proteomic ដ៏ជាក់លាក់ និងទូលំទូលាយនៃ PDPL ។បន្ទាប់មកទៀត យើងបានអនុវត្ត PDPL ទៅឧបករណ៍ចម្លងចម្លងរោគដែលទាក់ទងនឹងជំងឺ BRD4 និង E3 Parkin ligase ហើយបានរកឃើញអន្តរកម្មដែលមិនស្គាល់ពីមុន។តាមរយៈការបញ្ចាំងហួសប្រមាណ ស្រទាប់ខាងក្រោមមិនស្គាល់ពីរគឺ Ssu72 និង SNW1 ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណសម្រាប់ផាកឃីន ដែលការរិចរិលរបស់វាត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយផ្លូវ ubiquitination-proteasome ។
ការកំណត់លក្ខណៈត្រឹមត្រូវនៃបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនបង្កប់នូវដំណើរការកោសិកាជាមូលដ្ឋានជាច្រើន។ដូច្នេះ ការធ្វើផែនទី spatiotemporal ដែលមានភាពត្រឹមត្រូវខ្ពស់នៃអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីននឹងផ្តល់នូវមូលដ្ឋានម៉ូលេគុលសម្រាប់ការបកស្រាយផ្លូវជីវសាស្រ្ត រោគសាស្ត្រ និងបង្អាក់អន្តរកម្មទាំងនេះសម្រាប់គោលបំណងព្យាបាល។ដល់ទីបញ្ចប់នេះ វិធីសាស្ត្រដែលមានសមត្ថភាពរកឃើញអន្តរកម្មបណ្តោះអាសន្ននៅក្នុងកោសិកា ឬជាលិកាដែលនៅរស់គឺពិតជាគួរឱ្យចង់បានណាស់។Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) ត្រូវបានប្រើជាប្រវត្តិសាស្ត្រដើម្បីកំណត់ដៃគូចងនៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានចំណាប់អារម្មណ៍ (POIs) ។ជាមួយនឹងការអភិវឌ្ឍន៍នៃវិធីសាស្រ្ត proteomics បរិមាណ Bioplex3.0 ត្រូវបានបង្កើតឡើង ដែលជាមូលដ្ឋានទិន្នន័យធំបំផុតនៃបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនផ្អែកលើ AP-MS ។ថ្វីបើ AP-MS មានថាមពលខ្លាំងក៏ដោយ ដំណាក់កាលនៃកោសិកា និងសារធាតុរំលាយនៅក្នុងលំហូរការងារគឺមានភាពលំអៀងឆ្ពោះទៅរកអន្តរកម្មចងខ្សោយ និងបណ្តោះអាសន្ន និងណែនាំវត្ថុបុរាណក្រោយការលីលីស ដូចជាគូអន្តរកម្មដែលមិនច្បាស់លាស់ដែលខ្វះការបែងចែកមុនពេល lysis ។
ដើម្បីដោះស្រាយបញ្ហាទាំងនេះ អាស៊ីតអាមីណូខុសពីធម្មជាតិ (UAA) ដែលមានក្រុមឆ្លងកាត់តំណភ្ជាប់ និងប្រព័ន្ធដាក់ស្លាកក្បែរអង់ស៊ីម (PL) (ឧទាហរណ៍ APEX និង BioID)5 ត្រូវបានបង្កើតឡើង។ទោះបីជាវិធីសាស្ត្រ UAA ត្រូវបានអនុវត្តដោយជោគជ័យនៅក្នុងសេណារីយ៉ូជាច្រើន និងផ្តល់ព័ត៌មានអំពីការភ្ជាប់ប្រូតេអ៊ីនដោយផ្ទាល់ក៏ដោយ ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃគេហទំព័របញ្ចូល UAA នៅតែត្រូវបានទាមទារ។សំខាន់ជាងនេះទៅទៀត វាគឺជាវិធីសាស្ត្រដាក់ស្លាក stoichiometric ដែលខ្វះកាតាលីករបញ្ច្រាសនៃព្រឹត្តិការណ៍ដាក់ស្លាក។ផ្ទុយទៅវិញ វិធីសាស្ត្រ PL នៃអង់ស៊ីម ដូចជាវិធីសាស្ត្រ BioID រួមបញ្ចូលគ្នានូវ biotin ligase ដែលត្រូវបានវិស្វកម្មទៅជា POI7 ដែលជាបន្តបន្ទាប់ធ្វើឱ្យ biotin សកម្មដើម្បីបង្កើតជាប្រតិកម្ម biotinyl-AMP ester intermediate ។ដូច្នេះ អង់ស៊ីមនេះជំរុញ និងបញ្ចេញ biotin "ពពក" ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម ដែលដាក់ស្លាកសំណល់ lysine ជិតៗ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ BioID ត្រូវការច្រើនជាង 12 ម៉ោងដើម្បីទទួលបានសញ្ញាដែលមានស្លាកសញ្ញាគ្រប់គ្រាន់ ដែលរារាំងការប្រើប្រាស់របស់វាជាមួយនឹងដំណោះស្រាយបណ្តោះអាសន្ន។ដោយប្រើការវិវត្តន៍ដោយផ្ទាល់ដោយផ្អែកលើការបង្ហាញផ្សិត TurboID ត្រូវបានរចនាឡើងដោយផ្អែកលើ BioID ដើម្បីឱ្យកាន់តែមានប្រសិទ្ធភាព ដែលអនុញ្ញាតឱ្យដាក់ស្លាកប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពជាមួយ biotin ក្នុងរយៈពេល 10 នាទី ដែលអនុញ្ញាតឱ្យដំណើរការសិក្សាកាន់តែសកម្ម។ដោយសារ TurboID មានសកម្មភាពខ្ពស់ ហើយកម្រិត biotin ដែលគ្មានជាតិគីមីគឺគ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ការដាក់ស្លាកកម្រិតទាប ការដាក់ស្លាកផ្ទៃខាងក្រោយក្លាយជាបញ្ហាដែលអាចកើតមាននៅពេលដែលការដាក់ស្លាកសញ្ញាដែលប្រសើរឡើង និងកំណត់ពេលវេលាត្រូវបានទាមទារដោយការបន្ថែម biotin ខាងក្រៅ។លើសពីនេះទៀត esters ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មមានប្រតិកម្មមិនល្អ (t1/2 ~ 5 នាទី) ដែលអាចនាំទៅរកកាំស្លាកធំ ជាពិសេសបន្ទាប់ពីការតិត្ថិភាពនៃប្រូតេអ៊ីនជិតខាងជាមួយនឹង biotin 5។ នៅក្នុងវិធីសាស្រ្តមួយផ្សេងទៀត ការលាយហ្សែននៃ ascorbate peroxidase (ឧទាហរណ៍ biotin- រ៉ាឌីកាល់ phenol និងអនុញ្ញាតឱ្យដាក់ស្លាកប្រូតេអ៊ីនក្នុងរយៈពេលមួយនាទី 9,10 ។ APEX ត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណកោសិការងកោសិកា ប្រូតេអ៊ីនភ្នាស និងស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនដែលមានសញ្ញា cytosolic 11,12។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ តម្រូវការសម្រាប់កំហាប់ខ្ពស់នៃ peroxides អាចប៉ះពាល់ដល់ប្រូតេអ៊ីន redox ឬផ្លូវដែលរំខាន។ ដំណើរការកោសិកា។
ដូច្នេះ វិធីសាស្រ្តថ្មីមួយដែលមានសមត្ថភាពបង្កើតប្រភេទសត្វទប់ស្កាត់កាំជ្រួចដែលមានស្លាកប្រតិកម្មបន្ថែមទៀត ជាមួយនឹងភាពត្រឹមត្រូវខ្ពស់ក្នុងលំហ និងបណ្ដោះអាសន្នដោយមិនរំខានដល់ផ្លូវកោសិកា នឹងក្លាយជាការបន្ថែមដ៏សំខាន់មួយចំពោះវិធីសាស្ត្រដែលមានស្រាប់។ ក្នុងចំណោមប្រភេទសត្វដែលមានប្រតិកម្ម អុកស៊ីហ្សែន singlet បានជំរុញការយកចិត្តទុកដាក់របស់យើងដោយសារតែអាយុកាលខ្លីរបស់វា និងកាំនៃការសាយភាយមានកំណត់ (t1/2 < 0.6 µs ក្នុងកោសិកា) 13. ក្នុងចំណោមប្រភេទសត្វដែលមានប្រតិកម្ម អុកស៊ីហ្សែន singlet បានជំរុញការយកចិត្តទុកដាក់របស់យើងដោយសារតែអាយុកាលខ្លីរបស់វា និងកាំនៃការសាយភាយមានកំណត់ (t1/2 < 0.6 µs ក្នុងកោសិកា) 13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени х 1 дсмени жизни и врани . ក្នុងចំណោមទម្រង់សកម្ម អុកស៊ីហ្សែន singlet បានទាក់ទាញចំណាប់អារម្មណ៍របស់យើងដោយសារតែអាយុកាលខ្លីរបស់វា និងកាំនៃការសាយភាយមានកំណត់ (t1/2 < 0.6 µs ក្នុងកោសិកា) 13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）而引起而引起 1/2 < 0.6 µs) 而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времание привлекаени синглетный кислород из-за его короткого времени дремени жиз че ранограна и огранограна и огранограста ក្នុងចំណោមទម្រង់សកម្ម អុកស៊ីសែន singlet ទាក់ទាញការយកចិត្តទុកដាក់របស់យើង ដោយសារអាយុកាលខ្លីរបស់វា និងកាំនៃការសាយភាយមានកំណត់ (t1/2 < 0.6 μs នៅក្នុងកោសិកា)។អុកស៊ីសែន Singlet ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថាធ្វើអុកស៊ីតកម្មដោយចៃដន្យនូវ methionine, tyrosine, histidine និង tryptophan ដែលធ្វើឱ្យវាមានប៉ូល 14,15 សម្រាប់ភ្ជាប់ទៅ amine ឬ thiol ដែលមានមូលដ្ឋានលើ probes16,17 ។ទោះបីជាអុកស៊ីសែន singlet ត្រូវបានប្រើដើម្បីដាក់ស្លាក RNA នៃផ្នែករងនៃកោសិកាក៏ដោយ ក៏យុទ្ធសាស្រ្តសម្រាប់ការប្រើឡើងវិញនូវសញ្ញាសម្គាល់ជិត POI ដែលគ្មានសារធាតុពុលនៅតែមិនទាន់ត្រូវបានរុករកនៅឡើយ។នៅទីនេះ យើងបង្ហាញវេទិកាមួយដែលមានឈ្មោះថា photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL) ដែលជាកន្លែងដែលយើងប្រើពន្លឺពណ៌ខៀវដើម្បីបំភ្លឺ POIs ដែលត្រូវបានបញ្ចូលគ្នាជាមួយ photoensitizer miniSOG និងកេះការបង្កើតអុកស៊ីហ្សែន singlet ដើម្បីកត់សុីសំណល់ proximal បន្តដោយការកែប្រែដែលមានផ្ទុក amine ដើម្បី oxidize probes គីមីចូលទៅក្នុង កោសិការស់នៅកម្រិតមធ្យម។.យើងបានសាកល្បងក្រុមស៊ើបអង្កេតគីមីដើម្បីបង្កើនភាពជាក់លាក់នៃស្លាក និងកំណត់ទីតាំងកែប្រែដោយប្រើលំហូរការងារ proteomics បើកចំហ។ការប្រៀបធៀបដោយចំហៀងនៃ PDPL ជាមួយ TurboID បង្ហាញពីការគ្របដណ្តប់ proteomic ដ៏ជាក់លាក់ និងទូលំទូលាយនៃ PDPL ។យើងបានអនុវត្តវិធីសាស្រ្តនេះចំពោះសញ្ញាសម្គាល់សរីរាង្គជាក់លាក់នៃ proteome កោសិការង និងការកំណត់អត្តសញ្ញាណទូទៅនៃដៃគូចងសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីននិយតកម្មអេពីហ្សែនដែលទាក់ទងនឹងជំងឺមហារីក BRD4 និង E3 ligase Parkin ដែលទាក់ទងនឹងជំងឺផាកឃីន ដែលបានបញ្ជាក់ទាំងបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនដែលគេស្គាល់ និងមិនស្គាល់។ អន្តរកម្ម។.សមត្ថភាពរបស់ PDPL ក្នុងការទទួលស្គាល់ស្រទាប់ខាងក្រោម E3 នៅក្នុងស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនធំតំណាងឱ្យស្ថានភាពដែលការទទួលស្គាល់ឧបករណ៍ចងដោយប្រយោលត្រូវបានទាមទារ។ស្រទាប់ខាងក្រោមផាកឃីនមិនស្គាល់ពីរដែលត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយ ubiquitination-proteasome ត្រូវបានបញ្ជាក់នៅក្នុងកន្លែង។
ការព្យាបាលដោយ Photodynamic (PDT)19 និង chromophore-assisted laser inactivation (CALI)20 ដែលក្នុងនោះការ irradiation ពន្លឺជាមួយ photosensitizers បង្កើតអុកស៊ីសែន singlet អាចអសកម្មប្រូតេអ៊ីនគោលដៅ ឬបណ្តាលឱ្យស្លាប់កោសិកា។ដោយសារអុកស៊ីសែន singlet គឺជាសារធាតុដែលមានប្រតិកម្មខ្ពស់ជាមួយនឹងចម្ងាយនៃការសាយភាយតាមទ្រឹស្តីប្រហែល 70 nm នោះ អុកស៊ីតកម្មមានកម្រិតនៅជុំវិញឧបករណ៍បញ្ចេញពន្លឺអាចគ្រប់គ្រងបាន។ដោយផ្អែកលើគោលគំនិតនេះ យើងបានសម្រេចចិត្តប្រើអុកស៊ីសែន singlet ដើម្បីសម្រេចបាននូវការដាក់ស្លាកយ៉ាងជិតស្និទ្ធនៃស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងកោសិការស់នៅ។យើងបានបង្កើតវិធីសាស្រ្តគីមីសាស្ត្រ PDPL ដើម្បីបំពេញមុខងារចំនួនបួន: (1) ដើម្បីជំរុញការបង្កើតអុកស៊ីសែន singlet សកម្មស្រដៀងទៅនឹងវិធីសាស្រ្ត PL enzymatic;(2) ផ្តល់ស្លាកកំណត់ពេលវេលានៅពេលចាប់ផ្តើមពន្លឺ;(3) ដោយការផ្លាស់ប្តូរ (4) ជៀសវាងការប្រើ cofactors endogenous (ដូចជា biotin) ដើម្បីកាត់បន្ថយផ្ទៃខាងក្រោយ ឬប្រើ reagents exogenous រំខានយ៉ាងខ្លាំង (ដូចជា peroxides) ដើម្បីកាត់បន្ថយការប៉ះពាល់កោសិកាទៅនឹងភាពតានតឹងបរិស្ថាន។
Photosensitizers អាចត្រូវបានបែងចែកជាពីរប្រភេទរួមមាន fluorophores ទម្ងន់ម៉ូលេគុលតូច (ឧ. rose bengal, methylene blue)22 និងប្រូតេអ៊ីនតូចៗដែលបានអ៊ិនកូដហ្សែន (ឧទាហរណ៍ miniSOG, KillerRed)23 ។ដើម្បីសម្រេចបាននូវការរចនាម៉ូឌុល យើងបានបង្កើតវេទិកា PDPL ជំនាន់ទី 1 ដោយបន្ថែមប្រូតេអ៊ីន photosensitizer (PS) ទៅ POI24,25 (រូបភាព 1a) ។នៅពេលដែល irradiated ជាមួយពន្លឺពណ៌ខៀវ អុកស៊ីហ្សែន singlet កត់សុីសំណល់អាស៊ីតអាមីណូ nucleophilic ជិតៗ ដែលបណ្តាលឱ្យមានប៉ូលប៉ូលុងដែលជាអេឡិចត្រូហ្វីលីក ហើយអាចធ្វើប្រតិកម្មបន្ថែមទៀតជាមួយ amine probe nucleophiles16,17។ការស៊ើបអង្កេតត្រូវបានរចនាឡើងជាមួយនឹងចំណុចទាញ alkyne ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យចុចគីមីសាស្ត្រ និងទាញចុះក្រោមសម្រាប់ការកំណត់លក្ខណៈ LC/MS/MS ។
រូបភាពជាគ្រោងការណ៍នៃការដាក់ស្លាកនៃស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនសម្របសម្រួលដោយ miniSOG ។នៅពេលប៉ះពាល់នឹងពន្លឺពណ៌ខៀវ កោសិកាដែលបង្ហាញ miniSOG-POI បង្កើតអុកស៊ីហ្សែន singlet ដែលកែប្រែប្រូតេអ៊ីនអន្តរកម្ម ប៉ុន្តែមិនមែនប្រូតេអ៊ីនដែលមិនចង។ផលិតផលកម្រិតមធ្យមនៃ photooxidation ត្រូវបានស្ទាក់ចាប់ដោយស្លាកបញ្ជូនបន្តនៃ amine chemical probe ដើម្បីបង្កើតជា covalent adducts ។ក្រុម alkynyl នៅលើ chemistry probe អនុញ្ញាតឱ្យចុច chemistry សម្រាប់ការពង្រឹងដោយការទាញចុះក្រោមដោយ LC-MS/MS quantitation។b រចនាសម្ព័ន្ធគីមីនៃការស៊ើបអង្កេតអាមីណូ 1-4 ។c ការវិភាគ fluorescent gel តំណាងនៃ mitochondrial ធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្ម mitochondrial proteomic markers ដែលសម្របសម្រួលដោយ miniSOG ដោយប្រើ probes 1-4 និង quantification ដោយផ្អែកលើ gel densitometry ។សមាមាត្រសញ្ញាទៅផ្ទៃខាងក្រោយនៃការស៊ើបអង្កេតគីមីត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើការពិសោធន៍ត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមានដោយមិនរាប់បញ្ចូលពន្លឺពណ៌ខៀវ ឬដោយប្រើកោសិកា HEK293T ដោយគ្មានកន្សោម miniSOG ។n = 2 គំរូឯករាជ្យជីវសាស្រ្ត។ចំណុចនីមួយៗតំណាងឱ្យការចម្លងជីវសាស្ត្រ។d ការរកឃើញតំណាង និងបរិមាណនៃ PDPL ដោយប្រើការស៊ើបអង្កេតដែលប្រសើរឡើង 3 នៅក្នុងវត្តមាន ឬអវត្តមាននៃសមាសធាតុ PDPL ដែលបានចង្អុលបង្ហាញដូចជា គ។n = 3 គំរូឯករាជ្យជីវសាស្រ្ត។ចំណុចនីមួយៗតំណាងឱ្យការចម្លងជីវសាស្ត្រ។បន្ទាត់កណ្តាល និងវីស្គីតំណាងឱ្យមធ្យម និង±គម្លាតស្តង់ដារ។CBB: Coomassie Brilliant Blue ។e រូបភាព Confocal នៃអុកស៊ីសែន singlet ជាមួយនឹងស្នាមប្រឡាក់ Si-DMA ពណ៌ក្រហមឆ្ងាយ។របារមាត្រដ្ឋាន: 10 µm ។ការពិសោធន៍រូបភាពជែល និងការបង្រួបបង្រួមត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតដោយឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។
យើងបានសាកល្បងជាដំបូងនូវសមត្ថភាពរបស់ឧបករណ៍បំលែងពន្លឺពណ៌ចាស់ទុំ miniSOG26 និង KillerRed23 ដែលបានបង្ហាញដោយស្ថេរភាពនៅក្នុង HEK293T ដើម្បីសម្របសម្រួលការដាក់ស្លាក propargylamine នៃ proteome ជាការស៊ើបអង្កេតគីមី (រូបភាពបន្ថែម 1a) ។ការវិភាគ fluorescence របស់ជែលបានបង្ហាញថាការដាក់ស្លាក proteome ទាំងមូលត្រូវបានសម្រេចដោយប្រើ miniSOG និងការ irradiation ពន្លឺពណ៌ខៀវខណៈពេលដែលមិនមានផលិតផលស្លាកសញ្ញាដែលអាចមើលឃើញត្រូវបានសង្កេតឃើញជាមួយ KillerRed ។ដើម្បីកែលម្អសមាមាត្រសញ្ញាទៅផ្ទៃខាងក្រោយ យើងបានសាកល្បងសំណុំនៃការស៊ើបអង្កេតគីមីដែលមានសារធាតុ aniline (1 និង 3) propylamine (2) ឬ benzylamine (4) ។យើងបានសង្កេតឃើញថាកោសិកា HEK293T ខ្លួនឯងមានសញ្ញាផ្ទៃខាងក្រោយខ្ពស់ជាងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងមិនមានពន្លឺពណ៌ខៀវ ប្រហែលជាដោយសារតែសារធាតុ riboflavin photosensitizer ដែលជាសារធាតុ flavin mononucleotide (FMN) 27 ។ ការស៊ើបអង្កេតគីមីដែលមានមូលដ្ឋានលើ Aniline 1 និង 3 បានផ្តល់ភាពជាក់លាក់ប្រសើរជាងមុន ដោយ HEK293T បង្ហាញស្ថិរភាព miniSOG នៅក្នុង mitochondria បង្ហាញពីការកើនឡើង > 8 ដងនៃសញ្ញាសម្រាប់ការស៊ើបអង្កេត 3 ខណៈពេលដែលការស៊ើបអង្កេត 2 បានប្រើក្នុងវិធីសាស្ត្រ RNA-labeling CAP-seq បង្ហាញតែ ~ 2.5- ការកើនឡើងនៃសញ្ញាផ្នត់ ទំនងជាដោយសារការពេញចិត្តនៃប្រតិកម្មខុសៗគ្នារវាង RNA និងប្រូតេអ៊ីន (រូបភាព 1b, គ)។ ការស៊ើបអង្កេតគីមីដែលមានមូលដ្ឋានលើ Aniline 1 និង 3 បានផ្តល់ភាពជាក់លាក់ប្រសើរជាងមុន ដោយ HEK293T បង្ហាញស្ថិរភាព miniSOG នៅក្នុង mitochondria បង្ហាញពីការកើនឡើង > 8 ដងនៃសញ្ញាសម្រាប់ការស៊ើបអង្កេត 3 ខណៈពេលដែលការស៊ើបអង្កេត 2 បានប្រើក្នុងវិធីសាស្ត្រ RNA-labeling CAP-seq បង្ហាញតែ ~ 2.5- ការកើនឡើងនៃសញ្ញាផ្នត់ ទំនងជាដោយសារការពេញចិត្តនៃប្រតិកម្មខុសៗគ្នារវាង RNA និងប្រូតេអ៊ីន (រូបភាព 1b, គ)។ការស៊ើបអង្កេតគីមីដែលមានមូលដ្ឋានលើ Aniline 1 និង 3 បានបង្ហាញពីភាពជាក់លាក់ប្រសើរជាងមុន: HEK293T ដែលបង្ហាញយ៉ាងរឹងមាំនូវ miniSOG នៅក្នុង mitochondria បង្ហាញច្រើនជាងការកើនឡើង 8 ដងនៃសញ្ញាសម្រាប់ការស៊ើបអង្កេត 3 ខណៈពេលដែលការស៊ើបអង្កេត 2 ដែលប្រើក្នុងវិធីសាស្ត្រដាក់ស្លាក CAP-seq RNA តែប៉ុណ្ណោះ។ បង្ហាញការកើនឡើងសញ្ញា ~ 2.5 ដង ប្រហែលជាដោយសារការពេញចិត្តនៃប្រតិកម្មផ្សេងគ្នារវាង RNA និងប្រូតេអ៊ីន (រូបភាព 1b, គ)។基于基于的的探针 1 和 3 和更好好特异性特异性特异性特异性粒体粒体粒体粒体粒体表达表达信号信号信号增加增加信号增加 ~ 用于于 rna 标记方法于于 rna 标记方法于于 rna 标记方法显示 cap-seq 的探针 2 探针显示 ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA和蛋白质之间的不同反应偏好 (图1b, c) ។基于基于的的化学 1 和 3 和 he 的特异性特异性特异性特异性中中中中稳定稳定信号信号信号增加增加增加于于于于于于于于于于 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAការស៊ើបអង្កេតគីមីដែលមានមូលដ្ឋានលើ Aniline 1 និង 3 មានភាពជាក់លាក់ល្អជាងមុន HEK293T បានបង្ហាញនូវ miniSOG ប្រកបដោយស្ថេរភាពនៅក្នុង mitochondria ហើយការស៊ើបអង្កេត 3 មានការកើនឡើងជាង 8 ដងក្នុងសញ្ញា ខណៈដែលការស៊ើបអង្កេត 2 សម្រាប់វិធីសាស្ត្រដាក់ស្លាក CAP-seq RNA បង្ហាញត្រឹមតែ ~ 2.5 ដងប៉ុណ្ណោះ។នៅក្នុងសញ្ញា ប្រហែលជាដោយសារការពេញចិត្តនៃប្រតិកម្មផ្សេងគ្នារវាង RNA និងប្រូតេអ៊ីន (រូបភាព 1b, គ)។លើសពីនេះទៀត ការស៊ើបអង្កេត 3 isomers និង hydrazine probes (probes 5, 6, 7) ត្រូវបានធ្វើតេស្ត ដោយបញ្ជាក់ពីការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃ probe 3 (រូបភាពបន្ថែម 1b,c)។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការវិភាគហ្វ្លុយអូរីសេនក្នុងជែលបានបង្ហាញពីប៉ារ៉ាម៉ែត្រពិសោធន៍ដែលបានធ្វើឱ្យប្រសើរផ្សេងទៀត៖ ប្រវែងរលកវិទ្យុសកម្ម (460 nm), កំហាប់ការស៊ើបអង្កេតគីមី (1 mM) និងពេលវេលា irradiation (20 នាទី) (រូបភាពបន្ថែម 2a–c) ។ការលុបចោលនូវសមាសធាតុ ឬជំហានណាមួយនៅក្នុងពិធីការ PDPL នាំឱ្យមានការប្តូរសញ្ញាយ៉ាងសំខាន់ទៅផ្ទៃខាងក្រោយ (រូបភាពទី 1 ឃ)។គួរកត់សម្គាល់ថាការដាក់ស្លាកប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងវត្តមានរបស់ sodium azide ឬ trolox ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាដើម្បីពន្លត់អុកស៊ីហ្សែន singlet ។វត្តមានរបស់ D2O ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាមានស្ថេរភាពអុកស៊ីសែន singlet ធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវសញ្ញាសម្គាល់។ដើម្បីស៊ើបអង្កេតការរួមចំណែកនៃប្រភេទអុកស៊ីតកម្មដែលមានប្រតិកម្មផ្សេងទៀតក្នុងការដាក់ស្លាក Mannitol និងវីតាមីន C ត្រូវបានបន្ថែមដើម្បីបង្កើតឧបករណ៍រើសអេតចាយរ៉ាឌីកាល់ hydroxyl និង superoxide រៀងគ្នា 18, 29 ប៉ុន្តែពួកគេមិនត្រូវបានរកឃើញដើម្បីកាត់បន្ថយការដាក់ស្លាកនោះទេ។ការបន្ថែម H2O2 ប៉ុន្តែមិនមានការបំភ្លឺ មិនមានលទ្ធផលនៅក្នុងការដាក់ស្លាក (រូបភាពបន្ថែម 3a) ។ការថតរូបអុកស៊ីសែនឯកតាហ្វ្លុយអូរីជាមួយការស៊ើបអង្កេត Si-DMA បានបញ្ជាក់ពីវត្តមាននៃអុកស៊ីហ្សែនទោលក្នុងខ្សែ HEK293T-miniSOG ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុងខ្សែ HEK293T ដើមទេ។លើសពីនេះទៀត mitoSOX Red មិនអាចរកឃើញការផលិត superoxide បន្ទាប់ពីការបំភ្លឺ (រូបភាពទី 1e និងរូបភាពបន្ថែម។ 3b) 30. ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញយ៉ាងខ្លាំងថា singlet oxygen គឺជាប្រភេទអុកស៊ីហ្សែនប្រតិកម្មសំខាន់ដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះការដាក់ស្លាក proteomic ជាបន្តបន្ទាប់។Cytotoxicity នៃ PDPL ត្រូវបានគេវាយតម្លៃរួមទាំងការបំភាយពន្លឺពណ៌ខៀវ និងការស៊ើបអង្កេតគីមី ហើយមិនមានការសង្កេតឃើញពីការពុលស៊ីតូតូស៊ីនសំខាន់ៗទេ (រូបបន្ថែម 4a)។
ដើម្បីសិក្សាពីយន្តការដាក់ស្លាក និងបើកការកំណត់អត្តសញ្ញាណ proteomic នៃស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនដោយប្រើ LC-MS/MS ដំបូងយើងត្រូវកំណត់ថាតើអាស៊ីតអាមីណូណាដែលត្រូវបានកែប្រែ និងម៉ាស់ដីសណ្តនៃស្លាកសញ្ញាស៊ើបអង្កេត។Methionine, histidine, tryptophan និង tyrosine ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថាត្រូវបានកែប្រែដោយ singlet oxygen14,15។យើងរួមបញ្ចូលលំហូរការងារ TOP-ABPP31 ជាមួយនឹងការស្វែងរកបើកចំហដែលមិនលំអៀងដែលផ្តល់ដោយវេទិកាកុំព្យូទ័រ FragPipe ផ្អែកលើ MSFragger32 ។បន្ទាប់ពីការកែប្រែអុកស៊ីហ្សែន singlet និងការដាក់ស្លាកការស៊ើបអង្កេតគីមី គីមីវិទ្យាចុចត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើស្លាកកាត់បន្ថយ biotin ដែលមានតំណភ្ជាប់ដែលអាចបំបែកបាន បន្ទាប់មកដោយការលាតសន្ធឹង neutravidin និងការរំលាយអាហារ trypsin ។សារធាតុ peptide ដែលបានកែប្រែ ដែលនៅតែភ្ជាប់ទៅនឹងជ័រនោះ ត្រូវបាន photocleaved សម្រាប់ការវិភាគ LC-MS/MS (រូបភាពទី 2a និងទិន្នន័យបន្ថែម 1)។ការកែប្រែមួយចំនួនធំបានកើតឡើងនៅទូទាំង proteome ជាមួយនឹងផែនទី peptide (PSM) ជាង 50 ដែលត្រូវគ្នាក្នុងបញ្ជី (រូបភាព 2b)។គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល យើងសង្កេតឃើញតែការកែប្រែនៃអ៊ីស្ទីឌីន ប្រហែលជាដោយសារតែប្រតិកម្មខ្ពស់នៃអ៊ីស្ទីឌីនអុកស៊ីតកម្មឆ្ពោះទៅរកការស៊ើបអង្កេត aniline ជាងអាស៊ីតអាមីណូដទៃទៀត។យោងតាមយន្តការដែលបានចេញផ្សាយនៃការកត់សុី histidine ដោយអុកស៊ីសែន singlet, 21,33 រចនាសម្ព័ន្ធដីសណ្ត - ម៉ាស់ដែលបានស្នើឡើងនៃ +229 Da ត្រូវគ្នាទៅនឹង adduct នៃ probe 3 ជាមួយ 2-oxo-histidine បន្ទាប់ពីការកត់សុីពីរខណៈពេលដែល +247 Da គឺជាផលិតផលអ៊ីដ្រូលីស្ទីក។ នៃ +229 ដា (រូបភាពបន្ថែម 5) ។ការវាយតម្លៃនៃវិសាលគម MS2 បានបង្ហាញពីភាពជឿជាក់ខ្ពស់នៃការកំណត់អត្តសញ្ញាណភាគច្រើននៃ y និង b ions រួមទាំងការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃ ions បំណែកដែលបានកែប្រែ (y និង b) (រូបភាព 2c) ។ការវិភាគបរិបទនៃលំដាប់មូលដ្ឋាននៃអ៊ីស្ទីឌីនដែលបានកែប្រែ PDPL បានបង្ហាញឱ្យឃើញនូវចំណូលចិត្តគំនូរកម្រិតមធ្យមសម្រាប់សំណល់អ៊ីដ្រូហ្វូប៊ីកតូចៗនៅទីតាំង ± 1 (រូបភាពបន្ថែម 4b) ។ជាមធ្យម 1.4 histidines ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណក្នុងមួយប្រូតេអ៊ីន ហើយទីតាំងនៃសញ្ញាសម្គាល់ទាំងនេះត្រូវបានកំណត់ដោយផ្ទៃដែលអាចចូលដំណើរការបានដោយសារធាតុរំលាយ (SASA) និងការវិភាគដែលទាក់ទងគ្នានៃសារធាតុរំលាយ (RSA) (រូបភាពបន្ថែម 4c,d)។
លំហូរការងារដែលមិនលំអៀងសម្រាប់សិក្សាការជ្រើសរើសសំណល់ដោយប្រើវេទិកាកុំព្យូទ័រ FragPipe ដំណើរការដោយ MSFragger ។តំណភ្ជាប់ដែលអាចបំបែកបានត្រូវបានប្រើនៅក្នុង Click chemistry ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យ photocleavage នៃ peptides ដែលបានកែប្រែពីជ័រ streptavidin ។ការស្វែងរកបើកចំហត្រូវបានចាប់ផ្តើមដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណការកែប្រែជាច្រើន ក៏ដូចជាសំណល់ដែលពាក់ព័ន្ធ។b កំណត់ម៉ាស់នៃការកែប្រែដែលកើតឡើងនៅទូទាំង proteome ។ផែនទី Peptide PSM ។c ចំណារពន្យល់អំពីវិសាលគម MS2 នៃគេហទំព័រ histidine ដែលបានកែប្រែជាមួយ probe 3. ជាឧទាហរណ៍តំណាង ប្រតិកម្ម covalent ជាមួយ probe 3 បានបន្ថែម +229.0938 Da ទៅអាស៊ីតអាមីណូដែលបានកែប្រែ។d ការវិភាគបំរែបំរួលត្រូវបានប្រើដើម្បីសាកល្បងសម្រាប់សញ្ញាសម្គាល់ PDPL ។PRDX3 (H155A, H225A) និង PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ត្រូវបានចម្លងជាមួយ plasmids ប្រភេទព្រៃសម្រាប់ការរកឃើញប្រឆាំងនឹងទង់ជាតិ។e សារធាតុ peptide សំយោគត្រូវបានប្រតិកម្មជាមួយនឹង miniSOG បន្សុតនៅក្នុងវត្តមាននៃការស៊ើបអង្កេត 3 ហើយផលិតផលដែលត្រូវគ្នាជាមួយ Δm +247 និង +229 ត្រូវបានកត់សម្គាល់នៅក្នុងវិសាលគម LC-MS ។f អន្តរកម្មពីប្រូតេអ៊ីនទៅប្រូតេអ៊ីនក្នុង vitro ដែលយកគំរូតាម miniSOG-6xHis-tag និង anti-6xHis antibody ។អង់ទីប៊ីយ៉ូទីន (streptavidin-HRP) និងការវិភាគប្រឆាំងនឹងកណ្ដុរខាងលិចនៃ ស្មុគ្រស្មាញអង្គបដិប្រាណ miniSOG-6xHis/anti-6xHis ដែលមានស្លាកជាមួយនឹងការស៊ើបអង្កេត 3 អាស្រ័យលើពេលវេលានៃការប៉ះពាល់នឹងពន្លឺ។ស្លាកសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីននីមួយៗត្រូវបានបង្ហាញក្នុងទម្ងន់ម៉ូលេគុលដែលត្រូវគ្នា៖ ខ្សែសង្វាក់ពន្លឺអង្គបដិប្រាណ LC, ខ្សែសង្វាក់ធ្ងន់អង់ទីករ HC ។ការពិសោធន៍ទាំងនេះត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតដោយឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។
សម្រាប់ការផ្ទៀងផ្ទាត់ជីវគីមីនៃកន្លែងដាក់ស្លាក PRDX3 និង PRDX1 ដែលត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយវិសាលគមធំត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរពី histidine ទៅ alanine ហើយបើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទព្រៃក្នុងការវិភាគការចម្លង។លទ្ធផល PDPL បានបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូរបានកាត់បន្ថយស្លាកសញ្ញាយ៉ាងខ្លាំង (រូបភាព 2d) ។ទន្ទឹមនឹងនេះ លំដាប់ peptide ដែលបានកំណត់នៅក្នុងការស្វែងរកបើកចំហត្រូវបានសំយោគ និងប្រតិកម្មនៅក្នុង vitro ជាមួយនឹង miniSOG បន្សុតនៅក្នុងវត្តមាននៃការស៊ើបអង្កេត 3 និងពន្លឺពណ៌ខៀវដែលផ្តល់ទិន្នផលផលិតផលជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរដ៏ធំនៃ +247 និង +229 Da នៅពេលរកឃើញដោយ LC-MS (រូបភាព .2e).)ដើម្បីសាកល្បងថាតើអន្តរកម្មនៃប្រូតេអ៊ីន proximal អាចត្រូវបានដាក់ស្លាកនៅក្នុង vitro ដើម្បីឆ្លើយតបទៅនឹងការធ្វើឱ្យសកម្មនៃរូបភាព miniSOG ដែរឬទេ យើងបានរចនាការធ្វើតេស្តភាពជិតសិប្បនិមិត្តមួយដោយអន្តរកម្មរវាងប្រូតេអ៊ីន miniSOG-6xHis និង anti-His monoclonal antibody in vitro (រូបភាព 2f)។នៅក្នុងការវិភាគនេះ យើងរំពឹងថាការដាក់ស្លាកជិតនៃអង្គបដិប្រាណធ្ងន់ និងខ្សែសង្វាក់ស្រាលជាមួយ miniSOG ។ជាការពិត ការប្រឆាំងនឹងកណ្តុរ (ការទទួលស្គាល់ខ្សែសង្វាក់ធ្ងន់ និងស្រាលនៃអង្គបដិប្រាណដែលមានស្លាកសញ្ញាប្រឆាំង 6xHis) និង streptavidin បស្ចិមប្រទេសបានបង្ហាញពីជីវគីមីដ៏រឹងមាំនៃខ្សែសង្វាក់ធ្ងន់ និងស្រាល។គួរកត់សម្គាល់ថា យើងបានកត់សម្គាល់ឃើញថា miniSOG autobiotinylation ដោយសារតែស្លាក 6xHis និងតំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់រវាងខ្សែសង្វាក់ស្រាល និងធ្ងន់ ដែលអាចទាក់ទងនឹងគម្លាតដែលបានពិពណ៌នាពីមុនរវាង lysine និង 2-oxo-histidine proximal response ។សរុបសេចក្តី យើងសន្និដ្ឋានថា PDPL កែប្រែអ៊ីស្ទីឌីនក្នុងលក្ខណៈដែលពឹងផ្អែកជិត។
គោលដៅបន្ទាប់របស់យើងគឺដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃកោសិការងដើម្បីសាកល្បងភាពជាក់លាក់នៃការដាក់ស្លាកនៅកន្លែង។ដូច្នេះហើយ យើងបានសម្តែងនូវភាពស្ថិតស្ថេរ miniSOG នៅក្នុងស្នូល ម៉ាទ្រីស mitochondrial ឬភ្នាស ER ខាងក្រៅនៃកោសិកា HEK293T (រូបភាព 3a)។ការវិភាគ fluorescence ជែលបានបង្ហាញពីក្រុមដែលមានស្លាកច្រើនក្រៃលែងនៅទីតាំងរងចំនួនបី ក៏ដូចជាគំរូស្លាកសញ្ញាផ្សេងៗគ្នា (រូបភាពទី 3 ខ)។ការវិភាគរូបភាពនៃហ្វ្លុយអូរីសបានបង្ហាញពីភាពជាក់លាក់ខ្ពស់នៃ PDPL (រូបភាព 3c) ។លំហូរការងារ PDPL ត្រូវបានបន្តដោយប្រតិកម្មចុចជាមួយនឹងថ្នាំជ្រលក់ rhodamine ដើម្បីកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធកោសិការងដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីស ហើយសញ្ញា PDPL ត្រូវបានផ្សំជាមួយ DAPI ឧបករណ៍តាមដាន mitochondrial ឬ ER trackers ដែលបញ្ជាក់ពីភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់នៃ PDPL ។សម្រាប់ទីតាំង organelle ទាំងបី ការប្រៀបធៀបចំហៀងម្ខាងនៃ PDPL ជាមួយ TurboID ដោយប្រើ avidin ខាងលិចបង្ហាញថា PDPL ត្រូវបានដាក់ស្លាកកាន់តែពិសេសបើប្រៀបធៀបទៅនឹងការគ្រប់គ្រងរៀងៗខ្លួន។នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌ PDPL ក្រុមដែលមានស្លាកសញ្ញាកាន់តែច្រើនបានបង្ហាញខ្លួន ដែលបង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាក PDPL បន្ថែមទៀត (រូបភាពបន្ថែម 6a-d)។
តំណាងគ្រោងការណ៍នៃការដាក់ស្លាក proteome ជាក់លាក់សរីរាង្គដែលសម្របសម្រួលដោយ miniSOG ។miniSOG កំណត់គោលដៅម៉ាទ្រីស mitochondrial តាមរយៈការលាយបញ្ចូលគ្នាទៅនឹង N-terminal 23 អាស៊ីតអាមីណូនៃ COX4 របស់មនុស្ស (mito-miniSOG) ស្នូលតាមរយៈការ fusion ទៅ H2B (nucleus-miniSOG) និង Sec61β តាមរយៈផ្នែកខាង cytoplasmic នៃភ្នាស ER (ER-miniSOG )ការចង្អុលបង្ហាញរួមមានរូបភាពជែល ការបង្ហាញរូបភាព និងវិសាលគមធំ។b រូបភាពជែលតំណាងនៃទម្រង់ PDPL ជាក់លាក់នៃសរីរាង្គចំនួនបី។CBB Coomassie Brilliant Blue ។c រូបភាពបង្រួបបង្រួមតំណាងនៃកោសិកា HEK293T បង្ហាញយ៉ាងស្ថិរភាព miniSOG ជាមួយនឹងការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មកោសិការងផ្សេងៗគ្នាដែលបានរកឃើញដោយអង្គបដិប្រាណដែលមានស្លាក V5 (ក្រហម)។សញ្ញាសម្គាល់កោសិការងត្រូវបានប្រើសម្រាប់ mitochondria និង ER (ពណ៌បៃតង) ។ដំណើរការការងាររបស់ PDPL រួមមានការរកឃើញនៃសារធាតុ proteomes កោសិការងដែលមានស្លាក miniSOG (ពណ៌លឿង) ដោយប្រើ Cy3-azide click chemistry ។របារមាត្រដ្ឋាន: 10 µm ។d ដីភ្នំភ្លើងនៃប្រូតេអូមដែលមានស្លាក PDPL នៅក្នុងសរីរាង្គផ្សេងៗដែលកំណត់ដោយបរិមាណដែលមិនមានស្លាកសញ្ញា (n = 3 ការពិសោធន៍ជីវសាស្ត្រឯករាជ្យ) ។ការធ្វើតេស្ត t-tailed Student's two-tailed ត្រូវបានប្រើនៅលើដីភ្នំភ្លើង។ប្រភេទព្រៃ HEK293T ត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន។ ប្រូតេអ៊ីនដែលបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម (p < 0.05 និង> ភាពខុសគ្នានៃអាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង 2 ដង) ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម (p < 0.05 និង> ភាពខុសគ្នានៃអាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង 2 ដង) ។ Значительно измененные белки выделены красным цветом (ទំ < 0,05 និង >2-кратная разница в интенсивиноси) ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម (p <0.05 និង>ភាពខុសគ្នា 2 ដងក្នុងអាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង)។显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2倍离子强度差异）។显着变化的蛋白质以红色突出显示 (p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (ទំ < 0,05 និង > 2-кратная разница в ионной силе) ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម (p <0.05 និង> ភាពខុសគ្នា 2 ដងក្នុងកម្លាំងអ៊ីយ៉ុង)។ប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ HEK293T-miniSOG ប៉ុន្តែមិនសំខាន់សម្រាប់ HEK293T ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌បៃតង។e ការវិភាគភាពជាក់លាក់នៃសំណុំទិន្នន័យ proteomic ពីការពិសោធន៍ ឃ.ចំនួនសរុបនៃប្រូតេអ៊ីនសំខាន់ៗតាមស្ថិតិនៅក្នុងសរីរាង្គនីមួយៗ (ចំណុចក្រហម និងបៃតង) ត្រូវបានសម្គាល់នៅផ្នែកខាងលើ។អ៊ីស្តូក្រាមបង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីនដែលបានធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៅក្នុងសរីរាង្គដោយផ្អែកលើ MitoCarta 3.0 ការវិភាគ GO និង A. Ting et al ។មនុស្ស។សំណុំទិន្នន័យដាច់ដោយឡែកសម្រាប់ mitochondria, nuclei និង ER ។ការពិសោធន៍ទាំងនេះត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតដោយឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ទិន្នន័យឆៅត្រូវបានផ្តល់ជាទម្រង់ឯកសារទិន្នន័យឆៅ។
ដោយមានការលើកទឹកចិត្តដោយលទ្ធផលនៃជែល និងរូបភាព បរិមាណគ្មានស្លាកសញ្ញាត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់បរិមាណនៃសារធាតុប្រូតេអូមដែលបានកំណត់នៅក្នុងសរីរាង្គនីមួយៗ (ទិន្នន័យបន្ថែម 2)។HEK293T ដែលមិនឆ្លងត្រូវបានប្រើប្រាស់ជាការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមានដើម្បីដកសញ្ញាសម្គាល់ផ្ទៃខាងក្រោយ។ ការវិភាគគ្រោងភ្នំភ្លើងបង្ហាញប្រូតេអ៊ីនដែលសំបូរទៅដោយប្រូតេអ៊ីន (p <0.05 និង>អាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង 2 ដង) ក៏ដូចជាប្រូតេអ៊ីន singleton ដែលមានវត្តមានតែនៅក្នុងបន្ទាត់បង្ហាញ miniSOG (រូបភាព 3d ចំណុចក្រហម និងបៃតង)។ ការវិភាគគ្រោងភ្នំភ្លើងបង្ហាញប្រូតេអ៊ីនដែលសំបូរទៅដោយប្រូតេអ៊ីន (p <0.05 និង>អាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង 2 ដង) ក៏ដូចជាប្រូតេអ៊ីន singleton ដែលមានវត្តមានតែនៅក្នុងបន្ទាត់បង្ហាញ miniSOG (រូបភាព 3d ចំណុចក្រហម និងបៃតង)។ Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ការវិភាគគ្រោងភ្នំភ្លើងបានបង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីនដែលសំបូរទៅដោយប្រូតេអ៊ីន (p<0.05 និង>អាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង 2 ដង) ក៏ដូចជាប្រូតេអ៊ីនតែមួយដែលមានតែនៅក្នុងបន្ទាត់បង្ហាញ miniSOG (រូបភាព 3d ចំណុចក្រហម និងបៃតង)។火山图火山图显示分析出出显着富集蛋白质蛋白质蛋白质 (P <0.05 和和离子强度强度) 以及存存存 minisog 表达表达中中的的蛋白质 (图 3d 红色红色红色绿色点绿色点)火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ការវិភាគគ្រោងភ្នំភ្លើងបានបង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីនដែលសំបូរទៅដោយប្រូតេអ៊ីន (p<0.05 និង>2x កម្លាំងអ៊ីយ៉ុង) ក៏ដូចជាប្រូតេអ៊ីនតែមួយដែលមានវត្តមាននៅក្នុងបន្ទាត់កន្សោម miniSOG ប៉ុណ្ណោះ (ចំណុចក្រហម និងបៃតងក្នុងរូបភាព 3d)។ការរួមបញ្ចូលទិន្នន័យទាំងនេះ យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ 1364, 461, និង 911 ដែលមានសារសំខាន់ជាស្ថិតិនៃប្រូតេអ៊ីន មីតូខនឌ្រៀ និង ER ភ្នាសខាងក្រៅរៀងៗខ្លួន។ដើម្បីវិភាគភាពត្រឹមត្រូវនៃ PDPL ដែលមានមូលដ្ឋានលើសរីរាង្គ យើងបានប្រើ MitoCarta 3.0 ការវិភាគហ្សែន Ontology (GO) និង A. Ting et al ។សំណុំទិន្នន័យ 8 ត្រូវបានប្រើប្រាស់សម្រាប់ mitochondria, nucleus និង ER ដើម្បីសាកល្បងភាពជាក់លាក់នៃសរីរាង្គនៃប្រូតេអ៊ីនដែលបានរកឃើញ ដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងភាពត្រឹមត្រូវនៃ 73.4, 78.5 និង 73.0% (រូបភាព 3e)។ភាពជាក់លាក់នៃ PDPL បញ្ជាក់ថា PDPL គឺជាឧបករណ៍ដ៏ល្អមួយសម្រាប់កំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអូមជាក់លាក់នៃសរីរាង្គ។គួរកត់សម្គាល់ថាការវិភាគ submitochondrial នៃប្រូតេអ៊ីន mitochondrial ដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណបានបង្ហាញថា proteome ជាប់ត្រូវបានចែកចាយជាចម្បងនៅក្នុងម៉ាទ្រីសនិងភ្នាសខាងក្នុង (226 និង 106 រៀងគ្នា) ដែលស្មើនឹង 91.7% (362) នៃចំនួនសរុបនៃប្រូតេអ៊ីន mitochondrial ដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។កម្រិតខ្ពស់នៃ PDPL ត្រូវបានបញ្ជាក់បន្ថែម (រូបភាពបន្ថែម 7a)។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការវិភាគលើនុយក្លេអែរបានបង្ហាញថា ប្រូតេអូមដែលចាប់យកត្រូវបានចែកចាយជាចម្បងនៅក្នុងស្នូល នុយក្លេអូប្លាស និងនុយក្លេអូល (រូបភាពបន្ថែម 7b)។ការវិភាគប្រូតេអូមនុយក្លេអ៊ែរជាមួយ peptide សញ្ញាមូលដ្ឋាននីយកម្មនុយក្លេអ៊ែរ (3xNLS) បានបង្ហាញពីភាពត្រឹមត្រូវស្រដៀងគ្នាទៅនឹងសំណង់ H2B (រូបភាពបន្ថែម 7c–h) ។ដើម្បីកំណត់ភាពជាក់លាក់នៃសញ្ញាសម្គាល់ PDPL, laminin នុយក្លេអ៊ែរ A ត្រូវបានជ្រើសរើសជាអន្ទាក់ POI7 ដែលត្រូវបានធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មដោយឡែកជាងនេះ។PDPL បានកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីនដែលសំបូរទៅដោយសារធាតុចិញ្ចឹមសំខាន់ៗចំនួន 36 ដែលក្នុងនោះ 12 ប្រូតេអ៊ីន (30.0% រួមទាំង lamin A) គឺជាប្រូតេអ៊ីនដែលមានអន្តរកម្ម lamin A លក្ខណៈល្អដែលត្រូវបានកត់សម្គាល់ដោយមូលដ្ឋានទិន្នន័យ String ជាមួយនឹងភាគរយខ្ពស់ជាងវិធីសាស្ត្រ BioID (ប្រូតេអ៊ីន 122) 28 នៃ 28 , 22.9 ។ %) 7. វិធីសាស្រ្តរបស់យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីនតិចជាងមុន ប្រហែលជាដោយសារតែកន្លែងដាក់ស្លាកមានកំណត់ ដែលអាចធ្វើទៅបានដោយអុកស៊ីសែន singlet សកម្មជាង។ការវិភាគរបស់ GO បានបង្ហាញថាប្រូតេអ៊ីនដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណមានទីតាំងសំខាន់នៅក្នុង nucleoplasm (26) ភ្នាសនុយក្លេអ៊ែរ (10) ភ្នាសនុយក្លេអ៊ែរ (9) និងរន្ធនុយក្លេអ៊ែរ (5) ។សរុបមក ប្រូតេអ៊ីនដែលមានមូលដ្ឋានលើនុយក្លេអ៊ែរទាំងនេះមានចំនួន 80% នៃប្រូតេអ៊ីនដែលសំបូរទៅដោយសារធាតុដែលបង្ហាញឱ្យឃើញបន្ថែមទៀតអំពីភាពជាក់លាក់នៃ PDPL (រូបភាពបន្ថែម 8a–d)។
ដោយបានបង្កើតសមត្ថភាពរបស់ PDPL ដើម្បីអនុវត្តការសម្គាល់ជិតនៅក្នុងសរីរាង្គ បន្ទាប់មកយើងបានសាកល្បងថាតើ PDPL អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីវិភាគដៃគូចង POI ដែរឬទេ។ជាពិសេស យើងបានស្វែងរកដើម្បីកំណត់ការវិភាគ PDPL នៃប្រូតេអ៊ីន cytosolic ដែលត្រូវបានចាត់ទុកថាជាគោលដៅពិបាកជាងសមភាគីដែលធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មភ្នាសរបស់ពួកគេ ដោយសារធម្មជាតិថាមវន្តខ្ពស់របស់ពួកគេ។ប្រូតេអ៊ីន bromodomain និង extraterminal (BET) BRD4 បានទាក់ទាញការយកចិត្តទុកដាក់របស់យើងចំពោះតួនាទីសំខាន់របស់វានៅក្នុងជំងឺផ្សេងៗ 35, 36 ។ស្មុគ្រស្មាញដែលបង្កើតឡើងដោយ BRD4 គឺជា coactivator transcriptional និងជាគោលដៅព្យាបាលដ៏សំខាន់។តាមរយៈការធ្វើនិយ័តកម្មការបញ្ចេញមតិនៃកត្តាចម្លងនៃ c-myc និង Wnt5a BRD4 ត្រូវបានគេគិតថាជាកត្តាកំណត់សំខាន់នៃជំងឺមហារីកឈាម myeloid ស្រួចស្រាវ (AML), multiple myeloma, lymphoma របស់ Burkitt, មហារីកពោះវៀនធំ និងជំងឺរលាក 37,38 ។លើសពីនេះទៀត មេរោគមួយចំនួនកំណត់គោលដៅ BRD4 ដើម្បីគ្រប់គ្រងការចម្លងមេរោគ និងកោសិកា ដូចជា papillomavirus មេរោគអេដស៍ និង SARS-CoV-236,39 ។
ដើម្បីគូសផែនទីអន្តរកម្ម BRD4 ដោយប្រើ PDPL យើងបានរួមបញ្ចូលគ្នានូវ miniSOG ជាមួយនឹង isoform N- ឬ C-terminal ខ្លីនៃ BRD4 ។លទ្ធផល Proteomic បានបង្ហាញពីកម្រិតខ្ពស់នៃការត្រួតស៊ីគ្នារវាងសំណង់ទាំងពីរ (រូបភាពបន្ថែម 9a)។ប្រូតេអូមនុយក្លេអ៊ែរដែលត្រូវបានសម្គាល់ដោយ miniSOG-H2B គ្របដណ្តប់ 77.6% នៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានអន្តរកម្មជាមួយ BRD4 (រូបភាពបន្ថែម 9b) ។បន្ទាប់មក ពេលវេលាផ្សេងគ្នានៃការបំភ្លឺ (2, 5, 10, 20 នាទី) ត្រូវបានប្រើដើម្បីកែតម្រូវកាំសម្គាល់ (រូបភាព 4a និងទិន្នន័យបន្ថែម 3)។យើងសន្និដ្ឋានថានៅរយៈពេលខ្លីជាងនេះ PDPL នឹងដាក់ស្លាកដៃគូដែលចងដោយផ្ទាល់ជាចម្បង ខណៈពេលដែលរយៈពេលវែងជាងនេះ នឹងរួមបញ្ចូលប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានកំណត់ក្នុងអំឡុងពេលនៃការធ្វើឱ្យសកម្មរូបថតខ្លីជាង ក៏ដូចជាគោលដៅដោយប្រយោលនៅក្នុងស្មុគ្រស្មាញដាក់ស្លាក។តាមការពិត យើងបានរកឃើញការត្រួតស៊ីគ្នាខ្លាំងរវាងចំណុចពេលវេលាដែលនៅជាប់គ្នា (84.6% សម្រាប់ 2 និង 5 នាទី; 87.7% សម្រាប់ 5 និង 10 នាទី; 98.7% សម្រាប់ 10 និង 20 នាទី) (រូបភាព 4b និងបន្ថែម រូបភព 9c) ។នៅក្នុងក្រុមពិសោធន៍ទាំងអស់ យើងបានរកឃើញមិនត្រឹមតែការដាក់ស្លាកដោយខ្លួនឯង BRD4 ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែគោលដៅដែលគេស្គាល់ជាច្រើនដូចជា MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, និង HMGB1 ដែលរៀបរាប់នៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យខ្សែអក្សរ។កម្លាំងអ៊ីយ៉ុងនៃគោលដៅទាំងនេះគឺសមាមាត្រទៅនឹងពេលវេលានៃការប៉ះពាល់ (រូបភាព 4c និងរូបភាពបន្ថែម 9d)។ការវិភាគ GO នៃប្រូតេអ៊ីនដែលបានកំណត់ក្នុងក្រុមរយៈពេល 2 នាទីបានបង្ហាញថាប្រូតេអ៊ីនដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណត្រូវបានធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៅក្នុងស្នូលហើយត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងការផ្លាស់ប្តូរ chromatin និងមុខងារ RNA polymerase ។មុខងារម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបង្កើនក្នុងការចងក្រូម៉ាទីនឬការចម្លងការចម្លងតាមការចម្លង ដែលស្របនឹងមុខងារ BRD4 (រូបភាព 4 ឃ)។ការវិភាគអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនដែលបើកដោយប្រព័ន្ធទិន្នន័យបានបង្ហាញពីកម្រិតដំបូងនៃអន្តរកម្មដោយប្រយោលរវាង BRD4 និង HDAC ស្មុគស្មាញអន្តរកម្មគ្រួសារដូចជា SIN3A, NOR2, BCOR និង SAP130 (រូបភាព 4e និងរូបភាពបន្ថែម 9e) ស្របតាម BRD4 និង HDAC ចងអ៊ីស្តូនអាស៊ីតអាសេទីល ..លើសពីនេះទៀត គោលដៅតំណាងដែលកំណត់ដោយ LC-MS/MS រួមមាន Sin3A, NSUN2, Fus, និង SFPQ ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការលាបពណ៌លោកខាងលិច (រូបភាព 4f)។ថ្មីៗនេះ isoform ខ្លីនៃ BRD4 ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថា បង្កើតជា nuclei ដែលមានលក្ខណៈសម្បត្តិបំបែកដំណាក់កាលរាវ-រាវ (LLPS) ។ប្រូតេអ៊ីនភ្ជាប់ RNA Fus និង SFPQ សម្រុះសម្រួល LLPS នៃដំណើរការកោសិកាផ្សេងៗ ហើយត្រូវបានគេកំណត់ថានៅទីនេះជាប្រូតេអ៊ីនចង BRD4 ដែលមិនមានការកត់ត្រា។អន្តរកម្មរវាង BRD4 និង SFPQ ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការពិសោធន៍ co-immunoprecipitation (co-IP) (រូបភាព 4g) ដែលបង្ហាញពីយន្តការមួយផ្សេងទៀតសម្រាប់ការបំបែកដំណាក់កាលរាវដែលសម្របសម្រួលដោយ BRD4 ដែលសមនឹងទទួលបានការស៊ើបអង្កេតបន្ថែម។រួមគ្នា លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា PDPL គឺជាវេទិកាដ៏ល្អសម្រាប់កំណត់អត្តសញ្ញាណអន្តរកម្ម BRD4 ដែលគេស្គាល់ ក៏ដូចជាប្រូតេអ៊ីនចងដែលមិនស្គាល់។
តំណាងគ្រោងការណ៍នៃការសម្គាល់ជិត BRD4 ដែលសម្របសម្រួលដោយ miniSOG ពេលវេលានៃការប៉ះពាល់៖ 2, 5, 10 និង 20 នាទី។b ការត្រួតស៊ីគ្នានៃប្រូតេអ៊ីនដែលបានកំណត់នៅពេលវេលាបំភ្លឺខុសៗគ្នា។ការបង្កើនប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុង HEK293T-miniSOG-BRD4 មានស្ថិតិគួរឱ្យកត់សម្គាល់បើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទ HEK293T ។c អាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុងនៅពេលកំណត់បរិមាណតំណាងដែលមិនមានស្លាកសញ្ញាដែលគេស្គាល់ថាប្រូតេអ៊ីនភ្ជាប់ BRD4 ក្នុងអំឡុងពេលនៃការប៉ះពាល់ជាក់លាក់។n = 3 គំរូឯករាជ្យជីវសាស្រ្ត។ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± គម្លាតស្តង់ដារ។d ការវិភាគហ្សែន ontological (GO) នៃប្រូតេអ៊ីនដែលបានកំណត់នៅក្នុងក្រុម 2 នាទី។លក្ខខណ្ឌ GO ដប់ដំបូងត្រូវបានរាយបញ្ជី។ពពុះត្រូវបានលាបពណ៌តាមប្រភេទពាក្យ GO ហើយទំហំពពុះគឺសមាមាត្រទៅនឹងចំនួនប្រូតេអ៊ីនដែលមានក្នុងពាក្យនីមួយៗ។e ការវិភាគខ្សែអក្សរនៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានអន្តរកម្មជាមួយ BRD4 ។រង្វង់ពណ៌លឿងគឺជាកាវដោយផ្ទាល់ ហើយរង្វង់ពណ៌ប្រផេះគឺជាស្រទាប់ទីមួយនៃកាវដោយប្រយោល។បន្ទាត់ក្រហមតំណាងឱ្យអន្តរកម្មដែលបានកំណត់ដោយពិសោធន៍ ហើយបន្ទាត់ពណ៌ខៀវតំណាងឱ្យអន្តរកម្មដែលបានព្យាករណ៍។f គោលដៅចង BRD4 តំណាងដែលបានកំណត់នៅក្នុង LC-MS/MS ត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយការ blotting លោកខាងលិច។g ការពិសោធន៍រួម immunoprecipitation បញ្ជាក់ពីអន្តរកម្មរវាង SFPQ និង BRD4 ។ការពិសោធន៍ទាំងនេះត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតដោយឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ទិន្នន័យឆៅត្រូវបានផ្តល់ជាទម្រង់ឯកសារទិន្នន័យឆៅ។
បន្ថែមពីលើការកំណត់អត្តសញ្ញាណគោលដៅដែលពាក់ព័ន្ធ POI ដែលមិនបានចុះឈ្មោះ យើងសន្មត់ថា PDPL នឹងមានលក្ខណៈសមរម្យសម្រាប់ការកំណត់ស្រទាប់ខាងក្រោមសម្រាប់អង់ស៊ីម ដែលនឹងតម្រូវឱ្យមានការកំណត់លក្ខណៈនៃប្រូតេអ៊ីនភ្ជាប់ដោយប្រយោលនៅក្នុងស្មុគស្មាញធំ ៗ ដើម្បីកត់សម្គាល់ស្រទាប់ខាងក្រោមដែលមិនបានចុះបញ្ជី។Parkin (អ៊ិនកូដដោយ PARK2) គឺជា E3 ligase ហើយការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងផាកឃីនត្រូវបានគេស្គាល់ថាបណ្តាលឱ្យមានជំងឺ autosomal recessive juvenile Parkinson's disease (AR-JP)42 ។លើសពីនេះ ផាកឃីនត្រូវបានគេពិពណ៌នាថាជាកត្តាចាំបាច់សម្រាប់ mitophagy (mitochondrial autophagy) និងការដកចេញនូវប្រភេទអុកស៊ីសែនដែលមានប្រតិកម្ម។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទោះបីជាស្រទាប់ខាងក្រោមផាកឃីនជាច្រើនត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណក៏ដោយ តួនាទីរបស់ផាកឃីននៅក្នុងជំងឺនេះនៅមិនទាន់ច្បាស់នៅឡើយ។ដើម្បីសម្គាល់ស្រទាប់ខាងក្រោមដែលមិនមានលក្ខណៈពិសេសរបស់វា PDPL ត្រូវបានសាកល្បងដោយបន្ថែម miniSOG ទៅ N- ឬ C-terminus នៃ parkin ។កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ carbonyl cyanide proton transporter m-chlorophenylhydrazone (CCCP) ដើម្បីធ្វើឱ្យ Parkin សកម្មតាមរយៈផ្លូវ PINK1-Parkin ។បើប្រៀបធៀបទៅនឹងលទ្ធផល BRD4 PDPL របស់យើង ការលាយបញ្ចូលគ្នារបស់ Parkin N-terminus បានបង្ហាញពីសំណុំប្រូតេអ៊ីនគោលដៅធំជាង ទោះបីជាវាគ្របដណ្តប់ផ្នែកធំនៃ C-terminus (177 ក្នុងចំណោម 210) (រូបភាព 5a, b និងទិន្នន័យបន្ថែម 4)។លទ្ធផលគឺស្របជាមួយនឹងរបាយការណ៍ដែលថាស្លាក N-terminal អាចធ្វើឱ្យ Parkin44 សកម្មដោយចៃដន្យ។គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល មានតែប្រូតេអ៊ីនត្រួតស៊ីគ្នាចំនួន 18 នៅក្នុងទិន្នន័យរបស់យើងជាមួយនឹងលទ្ធផល AP-MS ដែលបានចេញផ្សាយសម្រាប់ Parkin43 ដែលទំនងជាដោយសារតែភាពខុសគ្នារវាងបន្ទាត់កោសិកា និងលំហូរការងារ proteomics ។បន្ថែមពីលើប្រូតេអ៊ីនដែលគេស្គាល់ចំនួនបួន (ARDM1, HSPA8, PSMD14, និង PSMC3) កំណត់ដោយវិធីសាស្រ្តពីរ (រូបភាព 5c)43 ។ដើម្បីធ្វើឱ្យលទ្ធផលនៃ LC-MS/MS មានសុពលភាពបន្ថែមទៀត ការព្យាបាល PDPL និងការលាបពណ៌បស្ចិមប្រទេសជាបន្តបន្ទាប់ត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រៀបធៀបលទ្ធផលនៃការវិភាគកោសិកាមេ HEK293T និងខ្សែ N-terminal parkin ដែលមានស្ថេរភាព។គោលដៅដែលមិនស្គាល់ពីមុន CDK2, DUT, CTBP1 និង PSMC4 ត្រូវបានសាកល្បងជាមួយនឹងឧបករណ៍ចងដែលគេស្គាល់ DNAJB1 (រូបភាព 5d)។
គ្រោងភ្នំភ្លើងនៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានអន្តរកម្មផាកឃីននៅក្នុងកោសិកា HEK293T ជាមួយនឹង miniSOG ដែលត្រូវបានបញ្ចេញដោយស្ថេរភាពបានបញ្ចូលគ្នាទៅនឹង N- ឬ C-terminus នៃ parkin (n = 3 ការពិសោធន៍ជីវសាស្រ្តឯករាជ្យ) ។ការធ្វើតេស្ត t-tailed Student's two-tailed ត្រូវបានប្រើនៅលើដីភ្នំភ្លើង។HEK293T ត្រូវបានប្រើជាការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន។ ប្រូតេអ៊ីនដែលបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម (p < 0.05 និង> ភាពខុសគ្នានៃអាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង 2 ដង) ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម (p < 0.05 និង> ភាពខុសគ្នានៃអាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង 2 ដង) ។ Значительно измененные белки выделены красным цветом (ទំ < 0,05 និង >2-кратная разница в интенсивиноси) ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម (p <0.05 និង>ភាពខុសគ្នា 2 ដងក្នុងអាំងតង់ស៊ីតេអ៊ីយ៉ុង)។显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2倍离子强度差异）។显着变化的蛋白质以红色突出显示 (p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (ទំ < 0,05 និង > 2-кратная разница в ионной силе) ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម (p <0.05 និង> ភាពខុសគ្នា 2 ដងក្នុងកម្លាំងអ៊ីយ៉ុង)។ប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ HEK293T-miniSOG ប៉ុន្តែមិនសំខាន់សម្រាប់ HEK293T ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌បៃតង។b ដ្យាក្រាម Venn បង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីនត្រួតស៊ីគ្នារវាងសំណង់ N-terminal និង C-terminal constructs ។ស្លាក N-terminal អាចធ្វើឱ្យផាកឃីនសកម្មដោយខុសឆ្គង ហើយបណ្តាលឱ្យមានប្រូតេអ៊ីនដែលអាចស្គាល់បាន។c ដ្យាក្រាម Venn បង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីនត្រួតស៊ីគ្នារវាង PDPL និង AP-MS ។អន្តរកម្មដែលគេស្គាល់ត្រូវបានរាយបញ្ជី រួមទាំងប្រូតេអ៊ីន 4 នៃ 18 ត្រួតស៊ីគ្នា និង 11 នៃប្រូតេអ៊ីន 159 ដែលត្រូវបានសម្គាល់ជាពិសេសនៅក្នុង PDPL ។d គោលដៅតំណាងដែលកំណត់ដោយ LC-MS/MS ត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយការ blotting លោកខាងលិច។e Ssu72 និង SNW1 ត្រូវបានកំណត់ថាជាស្រទាប់ខាងក្រោមផាកឃីនដែលមិនបានចុះឈ្មោះ។plasmids ប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាក FLAG ទាំងនេះត្រូវបានចម្លងទៅ HEK293T និង HEK293T-Parkin-miniSOG បន្តដោយការព្យាបាល CCCP នៅចំណុចផ្សេងៗ។ការរិចរិលត្រូវបានបញ្ចេញឱ្យកាន់តែច្បាស់នៅក្នុងខ្សែបន្ទាត់ Parkin overexpression ។f ដោយប្រើ proteasome inhibitor MG132 វាត្រូវបានបញ្ជាក់ថាដំណើរការ degradation នៃ Ssu72 និង SNW1 ត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយ proteasome-ubiquitination។ការពិសោធន៍ទាំងនេះត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតដោយឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ទិន្នន័យឆៅត្រូវបានផ្តល់ជាទម្រង់ឯកសារទិន្នន័យឆៅ។
គួរកត់សម្គាល់ថា ប្រូតេអ៊ីនដែលកំណត់ដោយ PDPL ត្រូវតែរួមបញ្ចូលប្រូតេអ៊ីនភ្ជាប់ Parkin និងស្រទាប់ខាងក្រោមរបស់វា។ដើម្បីរកមើលស្រទាប់ខាងក្រោមផាកឃីនដែលមិនបានចុះឈ្មោះ យើងបានជ្រើសរើសប្រូតេអ៊ីនដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណចំនួនប្រាំពីរ (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 និង SNW1) និង plasmids ឆ្លងដើម្បីបញ្ចោញហ្សែនទាំងនេះទៅជា HEK293T ធម្មតា និងបង្ហាញដោយស្ថេរភាពនូវការព្យាបាល miniSOG-Parkin's H2CP9 ។កម្រិតនៃប្រូតេអ៊ីន Ssu72 និង SNW1 ត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងបន្ទាត់ miniSOG-Parkin ដែលមានស្ថេរភាព (រូបភាព 5e) ។ការព្យាបាលជាមួយ CCCP អស់រយៈពេល 12 ម៉ោងបានបណ្តាលឱ្យមានការរិចរិលយ៉ាងខ្លាំងនៃស្រទាប់ខាងក្រោមទាំងពីរ។ដើម្បីស៊ើបអង្កេតថាតើការរិចរិលនៃ Ssu72 និង SNW1 ត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយ proteasome-ubiquitination នោះ proteasome inhibitor MG132 ត្រូវបានបន្ថែមដើម្បីរារាំងសកម្មភាព proteasome ហើយតាមពិតយើងបានរកឃើញថាដំណើរការ degradation របស់ពួកគេត្រូវបានរារាំង (រូបភាព 5f)។គោលដៅដែលមិនមែនជាស្រទាប់ខាងក្រោមបន្ថែមត្រូវបានបញ្ជាក់ថាជាអន្តរកម្មរបស់ Parkin ដោយប្រើការលាបពណ៌បស្ចិមប្រទេស (រូបភាពបន្ថែម 10) ដែលបង្ហាញលទ្ធផលស្របជាមួយ LC-MS/MS ។សរុបសេចក្តី ការធ្វើសមាហរណកម្មនៃលំហូរការងារ PDPL ជាមួយនឹងការផ្ទៀងផ្ទាត់ការផ្ទេរប្រូតេអ៊ីនគោលដៅអនុញ្ញាតឱ្យកំណត់អត្តសញ្ញាណស្រទាប់ខាងក្រោម E3 ligase ដែលមិនបានចុះបញ្ជី។
យើងបានបង្កើតវេទិកាសម្គាល់ជិតធម្មតាដែលអនុញ្ញាតឱ្យអ្នកកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងចន្លោះ និងពេលវេលាអន្តរកម្ម POIs ។វេទិកានេះមានមូលដ្ឋានលើប្រូតេអ៊ីន រស្មីសំយោគ miniSOG ដែលមានត្រឹមតែប្រហែល 12 kDa តិចជាងពាក់កណ្តាលនៃទំហំអង់ស៊ីម APEX2 ចាស់ទុំ (27 kDa) និងមួយភាគបីនៃទំហំ TurboID (35 kDa) ។ទំហំតូចជាងនេះគួរតែពង្រីកយ៉ាងខ្លាំងនូវកម្មវិធីសម្រាប់សិក្សាអំពីអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនតូចៗ។ការរុករកបន្ថែមនៃសារធាតុរស្មីសំយោគបន្ថែម មិនថាប្រូតេអ៊ីនដែលបានអ៊ិនកូដហ្សែន ឬម៉ូលេគុលតូចៗនោះទេ គឺត្រូវការជាចាំបាច់ដើម្បីបង្កើនទិន្នផលបរិមាណនៃអុកស៊ីសែន singlet និងពង្រីកភាពប្រែប្រួលនៃវិធីសាស្រ្តនេះ។សម្រាប់កំណែបច្ចុប្បន្ននៃ miniSOG គុណភាពបង្ហាញបណ្តោះអាសន្នខ្ពស់អាចត្រូវបានសម្រេចដោយប្រើការបំភ្លឺពណ៌ខៀវដើម្បីធ្វើឱ្យសញ្ញាសម្គាល់ជិតសកម្ម។លើសពីនេះ ពេលវេលានៃការប៉ះពាល់កាន់តែយូរបានបញ្ចេញ "ពពក" នៃអុកស៊ីសែន singlet ធំជាងមុន ដែលបណ្តាលឱ្យមានការកែប្រែសំណល់អ៊ីស្ទីឌីនឆ្ងាយៗ ការកើនឡើងកាំនៃស្លាកសញ្ញា និងសមត្ថភាពក្នុងការកែតម្រូវគុណភាពបង្ហាញលំហ PDPL ។យើងក៏បានសាកល្បងការស៊ើបអង្កេតគីមីចំនួន 7 ដើម្បីបង្កើនសមាមាត្រសញ្ញាទៅផ្ទៃខាងក្រោយ និងរុករកយន្តការម៉ូលេគុលនៅពីក្រោយវិធីសាស្រ្តនេះ។ដំណើរការការងារ TOP-ABPP រួមបញ្ចូលគ្នាជាមួយនឹងការស្វែងរកបើកចំហដែលមិនលំអៀងបានបញ្ជាក់ថាការកែប្រែបានកើតឡើងតែនៅក្នុង histidines ប៉ុណ្ណោះ ហើយមិនមាន microenvironment ជាប់លាប់ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញសម្រាប់ការកើនឡើងនៃការកែប្រែ histidine លើកលែងតែចំណង់ចំណូលចិត្តកម្រិតមធ្យមសម្រាប់ histidines នៅក្នុងតំបន់រង្វិលជុំ។
PDPL ក៏ត្រូវបានប្រើប្រាស់ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃកោសិការងដោយភាពជាក់លាក់នៃប្រូតេអូម និងការគ្របដណ្តប់យ៉ាងហោចណាស់អាចប្រៀបធៀបទៅនឹងការដាក់ស្លាកជិតផ្សេងទៀត និងវិធីសាស្ត្រស៊ើបអង្កេតគីមីជាក់លាក់នៃសរីរាង្គ។សញ្ញាសម្គាល់ជិតក៏ត្រូវបានប្រើដោយជោគជ័យដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃផ្ទៃ lysosomal និង proteomes ពាក់ព័ន្ធ secretome46,47 ។យើងជឿថា PDPL នឹងត្រូវគ្នាជាមួយសរីរាង្គរងទាំងនេះ។លើសពីនេះទៀត យើងបានជំទាស់នឹង PDPL ដោយកំណត់គោលដៅសម្រាប់ការចងប្រូតេអ៊ីន cytosolic ដែលស្មុគ្រស្មាញជាងប្រូតេអ៊ីនចងភ្នាស ដោយសារលក្ខណៈសម្បត្តិថាមវន្តរបស់ពួកគេ និងការចូលរួមក្នុងអន្តរកម្មខាងសាច់ឈាមកាន់តែច្រើន។PDPL ត្រូវបានគេអនុវត្តទៅលើប្រូតេអ៊ីនពីរ គឺអង់ស៊ីមចម្លង BRD4 និង ligase E3 Parkin ដែលទាក់ទងនឹងជំងឺ។ប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនេះត្រូវបានជ្រើសរើសមិនត្រឹមតែសម្រាប់មុខងារជីវសាស្រ្តជាមូលដ្ឋានរបស់ពួកគេប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែក៏សម្រាប់ភាពពាក់ព័ន្ធផ្នែកព្យាបាល និងសក្តានុពលព្យាបាលរបស់ពួកគេផងដែរ។សម្រាប់ POIs ទាំងពីរនេះ ដៃគូចងដ៏ល្បី ក៏ដូចជាគោលដៅដែលមិនបានចុះបញ្ជីត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។គួរកត់សម្គាល់ថា SFPQ ប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងការបំបែកដំណាក់កាលត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយសហ IP ដែលអាចបង្ហាញពីយន្តការថ្មីដែល BRD4 ( isoform ខ្លី) គ្រប់គ្រង LLPS ។ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ យើងជឿថាការកំណត់អត្តសញ្ញាណស្រទាប់ខាងក្រោម Parkin គឺជាសេណារីយ៉ូដែលការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃសារធាតុស្អិតដោយប្រយោលត្រូវបានទាមទារ។យើងបានរកឃើញស្រទាប់ខាងក្រោមផាកឃីនដែលមិនស្គាល់អត្តសញ្ញាណចំនួនពីរ ហើយបានបញ្ជាក់ពីការរិចរិលរបស់វានៅតាមបណ្តោយផ្លូវ ubiquitination-proteasome ។ថ្មីៗនេះ យុទ្ធសាស្ត្រដាក់អន្ទាក់ផ្អែកលើយន្តការមួយត្រូវបានបង្កើតឡើង ដើម្បីរកមើលស្រទាប់ខាងក្រោមអ៊ីដ្រូឡាស ដោយចាប់ពួកវាជាមួយអង់ស៊ីម។ថ្វីបើនេះជាវិធីសាស្រ្តដ៏មានអានុភាពខ្លាំងក៏ដោយ វាមិនស័ក្តិសមសម្រាប់ការវិភាគនៃស្រទាប់ខាងក្រោមដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការបង្កើតស្មុគ្រស្មាញធំៗ និងទាមទារឱ្យមានការបង្កើតចំណង covalent រវាងអង់ស៊ីម និងស្រទាប់ខាងក្រោម។យើងរំពឹងថា PDPL អាចត្រូវបានពង្រីកដើម្បីសិក្សាពីស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន និងគ្រួសារអង់ស៊ីមផ្សេងទៀត ដូចជាគ្រួសារ deubiquitinase និង metalloprotease ។
ទម្រង់ថ្មីនៃ miniSOG ដែលហៅថា SOPP3 ត្រូវបានបង្កើតឡើងជាមួយនឹងការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវការផលិតអុកស៊ីសែន singlet ។យើងបានប្រៀបធៀប miniSOG ជាមួយ SOPP3 ហើយបានរកឃើញការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនៃការសម្គាល់ ទោះបីជាសមាមាត្រសញ្ញាទៅសំឡេងរំខាននៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរ (រូបភាពបន្ថែម 11) ។យើងបានសន្មត់ថាការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃ SOPP3 (ឧ. តាមរយៈការវិវត្តន៍ផ្ទាល់) នឹងនាំទៅរកប្រូតេអ៊ីនដែលបញ្ចេញពន្លឺកាន់តែមានប្រសិទ្ធភាព ដែលទាមទារពេលវេលាពន្លឺខ្លីជាង ហើយដូច្នេះអនុញ្ញាតឱ្យចាប់យកដំណើរការកោសិកាថាមវន្តកាន់តែច្រើន។គួរកត់សម្គាល់ថាកំណែបច្ចុប្បន្ននៃ PDPL ត្រូវបានកំណត់ចំពោះបរិស្ថានកោសិកាព្រោះវាត្រូវការពន្លឺពណ៌ខៀវ ហើយមិនអាចជ្រាបចូលទៅក្នុងជាលិកាជ្រៅបានទេ។លក្ខណៈពិសេសនេះរារាំងការប្រើប្រាស់របស់វានៅក្នុងការសិក្សាគំរូសត្វ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ optogenetics ជាមួយ PDPL អាចផ្តល់ឱកាសសម្រាប់ការស្រាវជ្រាវសត្វ ជាពិសេសនៅក្នុងខួរក្បាល។លើសពីនេះ ឧបករណ៍បញ្ចេញពន្លឺអ៊ីនហ្វ្រារ៉េដដែលត្រូវបានវិស្វកម្មផ្សេងទៀតក៏ដកចេញនូវដែនកំណត់នេះផងដែរ។ការស្រាវជ្រាវកំពុងដំណើរការនៅក្នុងតំបន់នេះ។
ខ្សែក្រឡា HEK293T ត្រូវបានទទួលពី ATCC (CRL-3216)។ខ្សែកោសិកាបានធ្វើតេស្តអវិជ្ជមានចំពោះការឆ្លងមេរោគ mycoplasma ហើយត្រូវបានដាំដុះក្នុង DMEM (Thermo, #C11995500BT) ដែលត្រូវបានបន្ថែមដោយសេរ៉ូម bovine ទារក 10% (FBS, Vistech, #SE100-B) និង 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010)។លូតលាស់នៅក្នុង។
3-Aminophenylene (គំរូ 3) និង (4-ethynylphenyl) methanamine (គំរូ 4) ត្រូវបានទិញពី Bidepharm ។Propylamine (probe 2) ត្រូវបានទិញពី Energy-chemicals ។N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) ត្រូវបានសំយោគដោយយោងតាមវិធីសាស្ត្រដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយ។
តារាងបន្ថែមទី 1 រាយបញ្ជីហ្សែនដែលប្រើក្នុងការសិក្សានេះ។ស៊េរី miniSOG និង KillerRed ត្រូវបានក្លូនចេញពីអំណោយមួយពី P. Zou (សាកលវិទ្យាល័យប៉េកាំង)។លំដាប់កំណត់គោលដៅម៉ាទ្រីស mitochondrial គឺបានមកពីអាស៊ីតអាមីណូស្ថានីយ 23 N នៃ COX4 ហើយបានក្លូនទៅក្នុងវ៉ិចទ័រដែលបានចង្អុលបង្ហាញដោយប្រើការផ្គុំ Gibson (Beyotime, #D7010S) ។ដើម្បីកំណត់គោលដៅភ្នាស និងស្នូលនៃកោសិកា endoplasmic Reticulum SEC61B DNA មនុស្ស (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ត្រូវបានពង្រីកដោយ PCR ពីបណ្ណាល័យ cDNA នៃកោសិកា HEK293T និង H2B DNA (បរិច្ចាគដោយ D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) និងក្លូន ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ។លើកលែងតែមានការបញ្ជាក់ផ្សេងពីនេះ ហ្សែនប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតដែលប្រើសម្រាប់ការចម្លង និងការបង្កើតខ្សែកោសិកាដែលមានស្ថេរភាពត្រូវបានពង្រីក PCR ពីបណ្ណាល័យ cDNA កោសិកា HEK293T ។G3S (GGGS) និង G4S (GGGGS) ត្រូវបានប្រើជាតំណភ្ជាប់រវាងប្រូតេអ៊ីននុយ និង miniSOG ។ស្លាក Epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) ត្រូវបានបន្ថែមទៅសំណង់បញ្ចូលគ្នាទាំងនេះ។សម្រាប់ការបញ្ចេញមតិនៅក្នុងថនិកសត្វ និងដើម្បីបង្កើតបន្ទាត់កោសិកាដែលមានស្ថេរភាព រចនាសម្ព័ន្ធផ្សំ miniSOG ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងវ៉ិចទ័រ pLX304 lentiviral ។សម្រាប់កន្សោមបាក់តេរី miniSOG ត្រូវបានក្លូនទៅក្នុងវ៉ិចទ័រ pET21a ដែលមានស្លាក 6xHis នៅ C-terminus ។
កោសិកា HEK293T ត្រូវបានគេបណ្ដុះនៅកោសិកា 2.0 x 105 ក្នុងមួយអណ្តូងក្នុងចានអណ្តូងចំនួន 6 ហើយបានឆ្លង 24 ម៉ោងក្រោយមកជាមួយនឹង plasmids lentiviral recombinant (2.4 μg pLX304) និង plasmids វេចខ្ចប់មេរោគ (1.5 μg ដោយប្រើ psPAX2 និង 1.2 μg yotime) ។ , #C0533), ប្រហែល 80% លាយ។បន្ទាប់ពីការឆ្លងពេញមួយយប់ ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរ និង incubed សម្រាប់រយៈពេល 24 ម៉ោងទៀត។ការប្រមូលមេរោគត្រូវបានអនុវត្តបន្ទាប់ពី 24, 48 និង 72 ម៉ោង។មុនពេលឆ្លងមេរោគនៃកោសិកាគោលដៅ ឧបករណ៍ផ្ទុកមេរោគត្រូវបានត្រងតាមរយៈតម្រង 0.8 μm (Merck, #millex-GP) និង polybene (Solarbio, #H8761) ត្រូវបានបន្ថែមទៅកំហាប់ 8 μg/ml ។បន្ទាប់ពី 24 ម៉ោងកោសិកាត្រូវបានអនុញ្ញាតឱ្យងើបឡើងវិញដោយការផ្លាស់ប្តូរឧបករណ៍ផ្ទុក។កោសិកាត្រូវបានជ្រើសរើសដោយប្រើ 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) សម្រាប់វគ្គបីដំបូងជាជម្រើសដ៏តឹងរ៉ឹងទាប។បន្ទាប់មកប្រើ 20 μg/ml ជារបបតឹងរ៉ឹងជាងសម្រាប់វគ្គបីបន្ទាប់។
កោសិកាត្រូវបានបណ្ដុះក្នុងបន្ទប់អណ្តូងចំនួន 12 (Ibidi, #81201) នៅដង់ស៊ីតេប្រហែល 20,000 កោសិកាក្នុងមួយអណ្តូង។ដើម្បីកែលម្អការស្អិតជាប់នៃកោសិកា HEK293T បន្ថែមសារធាតុ fibronectin 50 µg/ml (Corning, #356008) ដែលពនលាយក្នុងទឹកអំបិល phosphate buffered saline (PBS, Sangon, #B640435) នៅសីតុណ្ហភាព 37°C។អង្គជំនុំជម្រះត្រូវបានគេរៀបចំទុកជាមុនរយៈពេល 1 ម៉ោងហើយបន្ទាប់មកយកចេញជាមួយ PBS ។បន្ទាប់ពី 24 ម៉ោង កោសិកាត្រូវលាងសម្អាតម្តងជាមួយ PBS ដោយ incubated ជាមួយ 1 mM probe 3 នៅក្នុងដំណោះស្រាយអំបិលដែលមានតុល្យភាពរបស់ Hanks ស្រស់ (HBSS, Gibco, #14025092) រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C ហើយបន្ទាប់មក incubated ជាមួយ LED ពណ៌ខៀវ (460 nm )) ត្រូវបាន irradiated សម្រាប់ 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់ពីនោះ កោសិកាត្រូវលាងសម្អាតពីរដងជាមួយ PBS និងជួសជុលជាមួយនឹងសារធាតុ formaldehyde 4% នៅក្នុង PBS (Sangon, #E672002) រយៈពេល 15 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។សារធាតុ formaldehyde លើសត្រូវបានយកចេញពីកោសិកាថេរដោយលាងបីដងជាមួយ PBS ។បន្ទាប់មកកោសិកាត្រូវបាន permeabilized ជាមួយ 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) នៅក្នុង PBS ហើយលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយ PBS ។បន្ទាប់មកយកអង្គជំនុំជម្រះចេញ ហើយបន្ថែមទៅសំណាកនីមួយៗ 25 µl នៃល្បាយប្រតិកម្មចុចដែលមាន 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) និង 0.5 mg/ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) និង incubated for 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់ពីប្រតិកម្មខ្ទាស់ កោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាត 6 ដងជាមួយនឹង PBS ដែលមាន 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានរារាំងដោយ 5% BSA (Abcone, #B24726) ក្នុង PBST រយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
សម្រាប់ colocalization immunostaining កោសិកាត្រូវបាន incubated ជាមួយអង្គបដិប្រាណបឋមតាមលក្ខខណ្ឌដែលបានចង្អុលបង្ហាញ៖ mouse anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), ទន្សាយ anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), អង់ទីករប្រឆាំងនឹង calnexin polyclonal របស់ទន្សាយ (1:500, Abcam, #ab22595) ឬទន្សាយ anti-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) នៅ 4 °C ពេញមួយយប់។បន្ទាប់ពីលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយ PBST កោសិកាត្រូវបាន incubated ជាមួយអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំ៖ ពពែប្រឆាំងនឹងទន្សាយ Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) ពនឺ 1:1000 ពពែប្រឆាំងកណ្ដុរ Alexa Fluor 594 (CST, #8889) ពនឺ 1:1000 ។dilution ពនលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 30 នាទី។បន្ទាប់មកកោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយ PBST និងប្រឡាក់ដោយ DAPI (Thermo, #D1306) ក្នុង PBS រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់ពីការលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយ PBS កោសិកាត្រូវបានផ្សាភ្ជាប់ក្នុង 50% glycerol (Sangon, #A600232) នៅក្នុង PBS សម្រាប់រូបភាព។រូបភាព Immunofluorescent ត្រូវបានទទួលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍បង្រួម ZEISS LSM 900 Airyscan2 និងកម្មវិធី ZNE 3.5 ។
សម្រាប់រូបភាព fluorescent អុកស៊ីហ្សែន singlet កោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាតពីរដងដោយប្រើ Hanks HEPES buffer មុនពេលបន្ថែម 100 nM Si-DMA នៅក្នុង Hanks HEPES buffer (DOJINDO, #MT05)។បន្ទាប់ពីការប៉ះពាល់នឹងពន្លឺ កោសិកាត្រូវបាន incubator ក្នុង CO2 incubator នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 45 នាទី។បន្ទាប់មកកោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាតពីរដងជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្ន HEPES របស់ Hanks ហើយត្រូវបានប្រឡាក់ដោយ Hoechst នៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន HEPES របស់ Hanks រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ និងមើលឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ ZEISS LSM 900 confocal ។, #M36008) នៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន HBSS ដែលមានជាតិកាល់ស្យូម និងម៉ាញ៉េស្យូម។បន្ទាប់ពីការប៉ះពាល់នឹងពន្លឺ ឬ doxorubicin (MCE, #HY-15142A) កោសិកាត្រូវបាន incubator ក្នុង CO2 incubator នៅសីតុណ្ហភាព 37° C. រយៈពេល 10 នាទី លាងសម្អាតពីរដងដោយ HBSS buffer និង incubated ជាមួយ Hoechst នៅក្នុង HBSS buffer នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។នាទីDoxorubicin ត្រូវបានគេប្រើជាការត្រួតពិនិត្យការស៊ើបអង្កេតវិជ្ជមានដែលកោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ 20 μM doxorubicin ក្នុង HBSS ដែលមាន 1% BSA សម្រាប់រយៈពេល 30 នាទី។រូបភាព Immunofluorescent ត្រូវបានទទួលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ Zeiss LSM 900 ។
កោសិកា HEK293T បង្ហាញដោយស្ថេរភាព mito-miniSOG ត្រូវបានបណ្តុះនៅដង់ស៊ីតេប្រហែល 30% ក្នុងចាន 15 សង់ទីម៉ែត្រ។បន្ទាប់ពី 48 ម៉ោងនៅពេលដែលការប្រសព្វគ្នា ~ 80% កោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាតម្តងជាមួយ PBS ដោយ incubed ជាមួយ 1 mM Probe 3 នៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន HBSS ស្រស់ក្នុងរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ° C ហើយបន្ទាប់មកបំភ្លឺដោយអំពូល LED ពណ៌ខៀវរយៈពេល 10 នាទីនៅក្នុងបន្ទប់។ សីតុណ្ហភាព។.បន្ទាប់ពីនោះ កោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាតពីរដងជាមួយនឹង PBS, ខ្ចាត់ខ្ចាយ និងផ្អាកឡើងវិញនៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន PBS ត្រជាក់ដែលមានផ្ទុកសារធាតុទប់ស្កាត់ប្រូតេអុីនគ្មាន EDTA (MCE, #HY-K0011)។កោសិកាត្រូវបាន lysed ដោយ sonicating គន្លឹះសម្រាប់ 1 នាទី (1 វិនាទីនៅលើនិង 1 វិនាទីបិទនៅ 35% amplitude) ។ល្បាយលទ្ធផលត្រូវបាន centrifuged នៅ 15,871 xg សម្រាប់រយៈពេល 10 នាទីនៅ 4°C ដើម្បីយកកំទេចកំទី ហើយកំហាប់ supernatant ត្រូវបានកែតម្រូវទៅ 4 mg/mL ដោយប្រើឧបករណ៍វិភាគប្រូតេអ៊ីន BCA (Beyotime, #P0009)។ផ្សំ 1 មីលីលីត្រនៃ lysate ខាងលើជាមួយ biotin azide 0.1 mM photodegradable biotin (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437) និង 1 mM CuSO4 incub ខាងក្រោម។ បង្វិលរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់ពីមានប្រតិកម្មមួយ បន្ថែមល្បាយទៅក្នុងដំណោះស្រាយដែលបានលាយមុន (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) ក្នុងដបកែវ 10 មីលីលីត្រ។សំណាកត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នានិងផ្ចិតនៅកម្រិត 4500 ក្រាមរយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ដំណោះស្រាយខាងក្រោម និងខាងលើត្រូវបានបោះចោល ទឹកភ្លៀងត្រូវបានលាងសម្អាតពីរដងជាមួយនឹង 1 មីលីលីត្រនៃមេតាណុល និង centrifuged នៅ 15871 × g រយៈពេល 5 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4 ° C ។បន្ថែម 1 មីលីលីត្រនៃ 8 M អ៊ុយ (Aladdin, លេខ U111902) ក្នុង 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) ដើម្បីរំលាយ precipitate ។គំរូត្រូវបានបង្កើតឡើងវិញជាមួយនឹង 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 ក្នុង 25 mM ABC) រយៈពេល 40 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 55 ° C បន្ទាប់មកដោយការបន្ថែម 15 mM iodoacetamide ស្រស់ (Sangon, #A600539) នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹត។Alkylation ក្នុងរយៈពេល 30 នាទី។.បន្ថែម 5 mM dithiothreitol ដើម្បីបញ្ឈប់ប្រតិកម្ម។រៀបចំប្រហែល 100 μl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) សម្រាប់សំណាកនីមួយៗដោយលាង 3 ដងជាមួយនឹង 1ml PBS ។ដំណោះស្រាយ proteome ខាងលើត្រូវបានពនឺជាមួយ 5 មីលីលីត្រ PBS និង incubated ជាមួយ beads NeutrAvidin agarose beads លាងមុនរយៈពេល 4 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់មកអង្កាំត្រូវបានលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយនឹង 5 មីលីលីត្រ PBS ដែលមាន 0.2% SDS (Sangon, #A600485) 3 ដងជាមួយ 5 មីលីលីត្រ PBS ដែលមានផ្ទុក 1M អ៊ុយ និង 3 ដងជាមួយ ddH2O 5 មីលីលីត្រ។បន្ទាប់មក អង្កាំត្រូវបានច្រូតកាត់ដោយ centrifugation និងផ្អាកឡើងវិញក្នុង 200 μl នៃ 25 mM ABC ដែលមាន 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) និង 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280) ។Trypsinize ពេញមួយយប់នៅ 37 ° C ជាមួយនឹងការបង្វិល។ប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ឈប់ដោយការបន្ថែមអាស៊ីត formic (Thermo, # A117-50) រហូតដល់ pH ឈានដល់ 2-3 ។អង្កាំត្រូវបានលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយ 1 មីលីលីត្រនៃ PBS ដែលមាន 0.2% SDS, 3 ដងជាមួយ 1 មីលីលីត្រនៃ PBS ដែលមាន 1 M អ៊ុយហើយបន្ទាប់មក 3 ដងជាមួយទឹកចម្រោះ 1 មីលីលីត្រ។សារធាតុ peptides ដែលត្រូវបានកែប្រែត្រូវបានបញ្ចេញដោយ light lysis (365 nm) រយៈពេល 90 នាទីដោយប្រើ 200 μl នៃ 70% MeOH ។បន្ទាប់ពីចាប់ផ្ចិតផ្ចិតហើយ កំពូលមនុស្សត្រូវបានប្រមូល។បន្ទាប់មកអង្កាំត្រូវបានលាងសម្អាតម្តងជាមួយនឹង 100 μl នៃ 70% MeOH ហើយ supernatants ត្រូវបានបញ្ចូល។គំរូត្រូវបានសម្ងួតក្នុងម៉ាស៊ីនបូមធូលី Speedvac ហើយរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -20°C រហូតដល់ការវិភាគ។
ដើម្បីកំណត់ និងកំណត់បរិមាណ peptides ដែលបានកែប្រែអុកស៊ីសែន singlet សំណាកត្រូវបានរំលាយឡើងវិញក្នុងអាស៊ីត formic 0.1% និង 1 μg នៃ peptides ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer បំពាក់ដោយប្រភពណាណូ ESI ពី Tune និង Xcalibur ពីកម្មវិធីអ្នកលក់ 4.3 ។គំរូត្រូវបានបំបែកនៅលើជួរឈរ capillary ខាងក្នុងទំហំ 75 µm × 15 សង់ទីម៉ែត្រដែលមានសម្ភារៈ 3 µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) និងភ្ជាប់ទៅប្រព័ន្ធ EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo) ។peptides ត្រូវបានបំបែកដោយលីនេអ៊ែរ 95 នាទី gradient chromatography ពី 8% សារធាតុរំលាយ B ទៅ 50% សារធាតុរំលាយ B (A = 0.1% អាស៊ីត formic ក្នុងទឹក, B = 0.1% អាស៊ីត formic ក្នុង 80% acetonitrile) បន្ទាប់មកលីនេអ៊ែរកើនឡើងដល់ 98% B នាទី ក្នុងរយៈពេល 6 នាទីក្នុងអត្រាលំហូរ 300 nl / នាទី។Orbitrap Fusion Lumos ប្រមូលទិន្នន័យឆ្លាស់គ្នារវាង MS scan និង MS2 scan អាស្រ័យលើទិន្នន័យ។វ៉ុល sputtering ត្រូវបានកំណត់ទៅ 2.1 kV និងសីតុណ្ហភាពនៃ capillary ដឹកជញ្ជូនអ៊ីយ៉ុងគឺ 320 ° C ។MS spectra (350-2000 m/z) ត្រូវបានប្រមូលជាមួយនឹងគុណភាពបង្ហាញ 120,000, AGC 4 × 105 និងពេលវេលាបញ្ចូលអតិបរមា 150 ms ។មុនគេដែលគិតថ្លៃច្រើនជាងគេបំផុតចំនួន 10 នៅក្នុងការស្កេនពេញលេញនីមួយៗត្រូវបានបែងចែកដោយប្រើ HCD ជាមួយនឹងថាមពលនៃការប៉ះទង្គិចធម្មតា 30%, បង្អួចដាច់ដោយឡែក quadrupole 1.6 m/z និងការកំណត់គុណភាពបង្ហាញ 30,000 ។គោលដៅ AGC សម្រាប់ tandem mass spectrometry ដោយប្រើ 5 × 104 និងពេលវេលាបញ្ចូលអតិបរមា 150 ms ។ការលើកលែងថាមវន្តត្រូវបានកំណត់ទៅ 30 វិនាទី។ អ៊ីយ៉ុងដែលមិនបានចាត់តាំង ឬអ្នកដែលមានការគិតថ្លៃ 1+ និង >7+ ត្រូវបានបដិសេធសម្រាប់ MS/MS។ អ៊ីយ៉ុងដែលមិនបានចាត់តាំង ឬអ្នកដែលមានការគិតថ្លៃ 1+ និង >7+ ត្រូវបានបដិសេធសម្រាប់ MS/MS។ Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ និង >7+ были отклонены для МС/МС។ អ៊ីយ៉ុង ឬអ៊ីយ៉ុងដែលមិនបានកំណត់ដោយគិតថ្លៃ 1+ និង >7+ ត្រូវបានបដិសេធសម្រាប់ MS/MS ។未指定的离子或电荷为1+ 和>7+的离子被拒绝用于MS/MS ។未指定的离子或电荷为1+ 和>7+的离子被拒绝用于MS/MS ។ Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ និង >7+ были отклонены для МС/МС។ អ៊ីយ៉ុង ឬអ៊ីយ៉ុងដែលមិនបានបញ្ជាក់ជាមួយនឹងការគិតថ្លៃ 1+ និង>7+ ត្រូវបានច្រានចោលសម្រាប់ MS/MS ។
ទិន្នន័យឆៅត្រូវបានដំណើរការដោយប្រើវេទិកាកុំព្យូទ័រ FragPipe ផ្អែកលើ MSFragger ។ភាពលំអៀងដ៏ធំ និងអាស៊ីតអាមីណូដែលត្រូវគ្នាត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើក្បួនដោះស្រាយការស្វែងរកបើកចំហជាមួយនឹងភាពធន់នៃម៉ាស់មុនពី -150 ទៅ 500 Da ។បន្ទាប់មក peptides ដែលបានកែប្រែត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយប្រើការកែប្រែ histidine ជាមួយនឹងការកើនឡើងដ៏ធំនៃ +229.0964 និង +247.1069 Da នៅក្នុង PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) ។
កោសិកាដែលបង្ហាញហ្សែនមីនីសូជីដែលលាយបញ្ចូលគ្នាដោយស្ថិរភាពត្រូវបានដាក់ក្នុងចានទំហំ 6 សង់ទីម៉ែត្រ។នៅពេលឈានដល់ចំណុចប្រសព្វ 80% កោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាតម្តងជាមួយ HBSS (Gibco, #14025092) បន្ទាប់មក incubated ជាមួយ chemical probes in HBSS រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C និងបំភ្លឺដោយពន្លឺពណ៌ខៀវ។អំពូល LED 10W រយៈពេល 20 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ដើម្បីកំណត់ថាតើប្រភេទអុកស៊ីហ្សែនប្រតិកម្មប្រភេទណាដែលពាក់ព័ន្ធនឹង PDPL, 0.5 mM វីតាមីន C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងកោសិកាជាអាហារបំប៉ន។បន្ទាប់ពីការលាងសម្អាតជាមួយនឹង PBS ត្រជាក់ កោសិកាត្រូវបានខ្ចាត់ខ្ចាយ ប្រមូលបានក្នុងបំពង់ centrifuge 1.5ml និង sonicated ជាមួយព័ត៌មានជំនួយរយៈពេល 1 នាទីក្នុង 200 μl នៃ PBS ជាមួយនឹង 1x protease inhibitor ដោយគ្មាន EDTA (1 s និង 1 s ដោយគ្មាន amplitude 35%) ។ល្បាយលទ្ធផលត្រូវបាន centrifuged នៅ 15,871 × g សម្រាប់រយៈពេល 10 នាទីនៅ 4 ° C ហើយកំហាប់ supernatant ត្រូវបានលៃតម្រូវទៅ 1 mg/mL ដោយប្រើឧបករណ៍វិភាគប្រូតេអ៊ីន BCA ។ប្រហែល 50 µl នៃ lysate ខាងលើត្រូវបាន incubated ជាមួយ 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand និង 1 mM CuSO4 រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាមួយនឹងការបង្វិលពីបាតទៅកំពូល។បន្ទាប់ពីប្រតិកម្មចុច ទឹកភ្លៀងជាមួយអាសេតូនត្រូវបានអនុវត្តដោយបន្ថែម 250 μlនៃអាសេតូនមុនត្រជាក់ទៅសំណាកដោយ incubating នៅ -20 ° C រយៈពេល 20 នាទី និង centrifuging នៅ 6010 × g រយៈពេល 10 នាទីនៅ 4 ° C ។ប្រមូលគ្រាប់ហើយដាំឱ្យពុះក្នុង 50 µl នៃ 1x Laemmli's buffer រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 95 °C។បន្ទាប់មក គំរូត្រូវបានវិភាគលើ Gels វែង SDS-PAGE និងមើលឃើញដោយប្រើប្រព័ន្ធរូបភាព Bio-rad ChemiDoc MP Touch ជាមួយនឹងកម្មវិធី Image Lab Touch ។
ការបញ្ចេញមតិ និងការបន្សុតនៃប្រូតេអ៊ីន miniSOG-6xHis recombinant ត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។ដោយសង្ខេប កោសិកា E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) ត្រូវបានបំប្លែងដោយ pET21a-miniSOG-6xHis ហើយការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបង្កឡើងដោយ 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168)។បន្ទាប់ពីការវិភាគកោសិកា ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបន្សុតដោយប្រើអង្កាំ Ni-NTA agarose (MCE, លេខ 70666) លាងជម្រះប្រឆាំងនឹង PBS និងរក្សាទុកនៅ -80 ° C ។
សម្រាប់ការធ្វើតេស្តភាពជិតស្លាកសញ្ញាដែលមានមូលដ្ឋានលើអង់ទីករ លាយ 100 μM purified miniSOG, 1 mM probe 3 និង 1 μg anti-label mouse monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) ក្នុង PBS ទៅនឹងបរិមាណប្រតិកម្មសរុប 50 μl។.ល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានបំភ្លឺដោយអំពូល LED ពណ៌ខៀវសម្រាប់រយៈពេល 0, 2, 5, 10 និង 20 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ល្បាយនេះត្រូវបាន incubated ជាមួយ 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand និង 1 mM CuSO4 សម្រាប់ 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់នៅលើ shaker ចលនាឡើងលើ។បន្ទាប់ពីប្រតិកម្មខ្ទាស់ បន្ថែមសតិបណ្ដោះអាសន្នរបស់ Laemmli 4x ដោយផ្ទាល់ទៅក្នុងល្បាយ ហើយដាំឱ្យពុះនៅសីតុណ្ហភាព 95°C រយៈពេល 10 នាទី។គំរូត្រូវបានវិភាគលើ SDS-PAGE gels និងវិភាគដោយការលាបពណ៌ខាងលិចជាមួយ streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068)។
peptide សំយោគដែលមានផ្ទុក histidine ជាមួយ C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) ត្រូវបានប្រើដើម្បីវិភាគការដាក់ស្លាក peptide ដែលមានមូលដ្ឋាននៅក្នុង vitro ។នៅក្នុងការវិភាគនេះ 100 μM purified miniSOG, 10 mM probe 3 និង 2 μg/ml peptide សំយោគត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នានៅក្នុង PBS ក្នុងបរិមាណប្រតិកម្មសរុប 50 μl។ល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបាន irradiated ជាមួយអំពូល LED ពណ៌ខៀវសម្រាប់រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។គំរូមួយមីក្រូលីត្រត្រូវបានវិភាគដោយប្រើប្រព័ន្ធ LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer ជាមួយនឹងកម្មវិធីវិភាគវិសាលគម MassLynx)។
កោសិកា HEK293T បង្ហាញដោយស្ថេរភាពនូវហ្សែនលាយ miniSOG ត្រូវបានបង្កាត់នៅក្នុងចាន 10 សង់ទីម៉ែត្រសម្រាប់បន្ទាត់ជាមួយនឹងការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មសរីរាង្គផ្សេងគ្នា (Mito, ER, Nucleus) និងចាន 15 សង់ទីម៉ែត្រសម្រាប់បន្ទាត់ Parkin-miniSOG និង BRD4-miniSOG ។នៅពេលឈានដល់ចំណុចប្រសព្វ 90% កោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាតម្តងជាមួយ HBSS បន្ទាប់មក incubated ជាមួយ probe 3 in HBSS រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ° C និងបំភ្លឺដោយអំពូល LED ពណ៌ខៀវ 10 W នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ចំពោះការផ្លាកសញ្ញាមិនទាក់ទងរបស់ផាកឃីន 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) ជាមួយនឹងការស៊ើបអង្កេត 3 ក្នុង HBSS ត្រូវបានបន្ថែមរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សាសេ។ដំណាក់កាលនៃកោសិកា lysis, គីមីវិទ្យា, ការកាត់បន្ថយ និង alkylation គឺដូចគ្នាទៅនឹងការពិពណ៌នាខាងលើ លើកលែងតែ 2 mg នៃ lysate ត្រូវបានបន្ថែម ហើយ biotin PEG3 azide ត្រូវបានប្រើក្នុងប្រតិកម្មចុចជំនួសឱ្យ biotin azide ដែលអាចបំបែកបាននៃ biotin ។បន្ទាប់ពីការពង្រឹងអងា្កំត្រូវបានទឹកនាំទៅ 3 ដងជាមួយនឹង 5 មីលីលីត្រនៃ PBS ដែលមាន 0.2% SDS, 3 ដងជាមួយនឹង 5 មីលីលីត្រនៃ PBS ដែលមាន 1 M អ៊ុយនិង 3 ដងជាមួយ 5 មីលីលីត្រនៃ PBS ។បន្ទាប់មក 2 µg trypsin ត្រូវបានបន្ថែមទៅ 300 µl 25 mM ABC ដែលមានអ៊ុយ 1 M ដើម្បីបំបែកប្រូតេអ៊ីនពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សារសេ។ប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ឈប់ដោយការបន្ថែមអាស៊ីត formic រហូតដល់ pH នៃ 2-3 ត្រូវបានឈានដល់។បន្ទាប់ពី trypsinization នៅលើអង្កាំ ដំណោះស្រាយ peptide ត្រូវបានលុបចោលដោយប្រើជួរឈរ SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) ហើយស្ងួតក្នុងម៉ាស៊ីនបូមធូលី Speedvac ។Peptides ត្រូវបានរំលាយឡើងវិញក្នុង 0.1% នៃអាស៊ីត formic និង 500 ng នៃ peptides ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer ដែលបំពាក់ដោយប្រភព nano-ESI ដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។Peptides ត្រូវបានបំបែកនៅលើជួរឈរ RP-HPLC ពាណិជ្ជកម្ម (75 μm x 2 សង់ទីម៉ែត្រ) (Thermo, លេខ 164946) និងជួរឈរ RP-HPLC វិភាគ (75 μm x 25 សង់ទីម៉ែត្រ) (Thermo, លេខ 164941) ទាំងពីរត្រូវបានបំពេញដោយ 2 μm។ជម្រាលពី 8% ទៅ 35% ACN ក្នុងរយៈពេល 60 នាទី បន្ទាប់មកកើនឡើងជាលីនេអ៊ែរដល់ 98% B ក្នុងរយៈពេល 6 នាទីក្នុងអត្រាលំហូរ 300 Nl / នាទី។MS spectra (350-1500 m/z) ត្រូវបានប្រមូលជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ 60,000, AGC 4 × 105 និងពេលវេលាបញ្ចូលអតិបរមា 50 ms ។អ៊ីយ៉ុងដែលបានជ្រើសរើសត្រូវបានបែងចែកតាមលំដាប់លំដោយដោយ HCD ក្នុងវដ្ត 3 s ជាមួយនឹងថាមពលប៉ះទង្គិចធម្មតានៃ 30%, បង្អួចដាច់ដោយឡែក quadrupole 1.6 m/z និងដំណោះស្រាយ 15000 នៃ 22 ms ត្រូវបានប្រើ។ការបដិសេធថាមវន្តត្រូវបានកំណត់ទៅ 45 វិនាទី។ អ៊ីយ៉ុងដែលមិនបានចាត់តាំង ឬអ្នកដែលមានការគិតថ្លៃ 1+ និង >7+ ត្រូវបានបដិសេធសម្រាប់ MS/MS។ អ៊ីយ៉ុងដែលមិនបានចាត់តាំង ឬអ្នកដែលមានការគិតថ្លៃ 1+ និង >7+ ត្រូវបានបដិសេធសម្រាប់ MS/MS។ Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ និង >7+ были отклонены для МС/МС។ អ៊ីយ៉ុង ឬអ៊ីយ៉ុងដែលមិនបានកំណត់ដោយគិតថ្លៃ 1+ និង >7+ ត្រូវបានបដិសេធសម្រាប់ MS/MS ។未指定的离子或电荷为1+ 和>7+的离子被拒绝用于MS/MS ។未指定的离子或电荷为1+ 和>7+的离子被拒绝用于MS/MS ។ Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ និង >7+ были отклонены для МС/МС។ អ៊ីយ៉ុង ឬអ៊ីយ៉ុងដែលមិនបានបញ្ជាក់ជាមួយនឹងការគិតថ្លៃ 1+ និង>7+ ត្រូវបានច្រានចោលសម្រាប់ MS/MS ។
ការរៀបចំគំរូឈានទៅដល់ការពង្រឹងនៃអង្កាំ NeutrAvidin គឺដូចគ្នាទៅនឹងការវិភាគ LC-MS/MS ដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។ប្រហែល 50 μgនៃ lysate ត្រូវបានគេប្រើជាធាតុបញ្ចូលសម្រាប់ការគ្រប់គ្រងការផ្ទុកហើយ 2 mg នៃ lysate ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ប្រតិកម្មចុច។បន្ទាប់ពីការចម្រាញ់ និងលាងសម្អាតជាមួយនឹងនឺត្រេវីឌីន ប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានចងត្រូវបានដកចេញដោយបន្ថែម 50 μlនៃសតិបណ្ដោះអាសន្នរបស់ Laemmli ទៅក្នុងអង្កាំជ័រ agarose ហើយដាំឱ្យពុះនៅសីតុណ្ហភាព 95 ° C. រយៈពេល 5 នាទី។ការត្រួតពិនិត្យការបញ្ចូលបន្ទុក និងសំណាកដែលសំបូរទៅដោយអង្កាំត្រូវបានវិភាគដោយ SDS-PAGE និងផ្ទេរទៅភ្នាស PVDF (Millipore, #ISEQ00010) ដោយវិធីសាស្ត្របស្ចឹមប្រទេសតាមស្តង់ដារ។ភ្នាសត្រូវបានរារាំងដោយទឹកដោះគោ 5% (Sangon, #A600669) នៅក្នុង TBS ដែលមាន 0.1% tween-20 (TBST) និង incubed ជាបន្តបន្ទាប់ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណបឋម និងអនុវិទ្យាល័យ។អង្គបដិបក្ខបឋមត្រូវបានពនលាយក្នុង 1:1000 ក្នុងទឹកដោះគោ 5% ក្នុង TBST និងបង្កកំណើតពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C។អង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំត្រូវបានគេប្រើក្នុងសមាមាត្រ 1:5000 និង incubated 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ភ្នាសត្រូវបានគេមើលឃើញដោយ chemiluminescence ដោយប្រើប្រព័ន្ធរូបភាព Chemidoc MP ។រាល់ការស្កែនដុំៗ និងជែលដែលមិនបានកាត់នៅក្នុងរូបត្រូវបានបង្ហាញជាទិន្នន័យឆៅ។
អង្គបដិប្រាណបឋមដែលប្រើក្នុងការសិក្សានេះរួមមាន ទន្សាយប្រឆាំងនឹង SFPQ monoclonal antibody (CST លេខ 71992) ទន្សាយ anti-FUS monoclonal antibody (CST លេខ 67840) ទន្សាយ anti-NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech លេខ 20854-1- AP), ទន្សាយប្រឆាំងនឹង mSin3A អង់ទីករ polyclonal (Abcam, #ab3479), អង់ទីករ monoclonal anti-tag របស់កណ្តុរ (TransGen, #HT201-02), អង់ទីករ monoclonal anti-β-actin របស់កណ្តុរ (TransGen, #HC201-01), ទន្សាយប្រឆាំង -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), អង់ទីករ monoclonal ទន្សាយទៅ CTBP1 (ABclonal, #A11600), អង់ទីករ polyclonal ទន្សាយទៅ DUT (ABclonal, #A2901), អង់ទីករ polyclonal ទន្សាយ ទៅ PSMC4 (ABclonal, #A-2505), ទន្សាយ antibody អង់ទីករ polyclonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504) ។អង្គបដិបក្ខទាំងនេះត្រូវបានគេប្រើប្រាស់ក្នុងកម្រិត 1:1000 ក្នុងទឹកដោះគោ 5% នៅក្នុង TBST។អង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំដែលប្រើក្នុងការសិក្សានេះរួមមាន ប្រឆាំងនឹងទន្សាយ IgG (TransGen, #HS101-01), ប្រឆាំងនឹងកណ្តុរ IgG (TransGen, #HS201-01) នៅកម្រិត 1: 5000 ។
ដើម្បីស៊ើបអង្កេតបន្ថែមថាតើ BRD4 មានអន្តរកម្មជាមួយ SFPQ ឬអត់ កោសិកា HEK293T និង BRD4-miniSOG ស្ថេរភាពដែលបង្ហាញ HEK293T ខ្លាំងពេកត្រូវបានគេដាក់ក្នុងចាន 10 សង់ទីម៉ែត្រ។កោសិកាត្រូវបានទឹកនាំទៅដោយ PBS ត្រជាក់ និង lysed ក្នុង 1 មីលីលីត្រ Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) ជាមួយនឹង EDTA-free protease inhibitor រយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4 °C។បន្ទាប់ពីនោះ lysates ត្រូវបានប្រមូលនៅក្នុងបំពង់ centrifuge 1.5 មីលីលីត្រ និង centrifuged នៅ 15,871 xg សម្រាប់ 10 នាទីនៅ 4 ° C ។អតិសុខុមប្រាណត្រូវបានប្រមូលផល និងភ្ញាស់ដោយ 5 µg នៃ anti-V5 ដែលមានស្លាក anti-V5 អង្គបដិប្រាណ monoclonal របស់កណ្តុរ (CST, #80076) ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ។លាងសមាតប្រហែល 50 µl នៃប្រូតេអ៊ីន A/G magnetic beads (MCE, #HY-K0202) ពីរដងជាមួយ PBS ដែលមាន 0.5% Tween-20 ។បន្ទាប់មកកោសិកា lysates ត្រូវបាន incubated ជាមួយ beads សម្រាប់រយៈពេល 4 ម៉ោងនៅ 4 ° C ជាមួយនឹងការបង្វិលពីបាតទៅកំពូល។បន្ទាប់មកអង្កាំត្រូវបានទឹកនាំទៅបួនដងជាមួយនឹង 1ml នៃ PBST buffer និងដាំឱ្យពុះនៅសីតុណ្ហភាព 95°C រយៈពេល 5 នាទី។គំរូត្រូវបានវិភាគលើ SDS-PAGE gels និងផ្ទេរទៅភ្នាស PVDF ដោយប្រើវិធីសាស្ត្របស្ចឹមប្រទេស។ភ្នាសត្រូវបានរារាំងនៅក្នុងទឹកដោះគោ 5% នៅក្នុង TBST និង incubated ជាបន្តបន្ទាប់ជាមួយនឹងអង្គបដិបក្ខបឋមសិក្សា និងបន្ទាប់បន្សំ។Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) ត្រូវបានគេប្រើក្នុងសមាមាត្រនៃ 1:1000 ក្នុងទឹកដោះគោ 5% នៅក្នុង TBST និង incubed មួយយប់នៅ 4 ° C ។ប្រឆាំងនឹងទន្សាយ IgG ត្រូវបានគេប្រើក្នុងសមាមាត្រនៃ 1: 5000 និង incubed រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ភ្នាសត្រូវបានគេមើលឃើញដោយ chemiluminescence ដោយប្រើប្រព័ន្ធរូបភាព Chemidoc MP ។
រចនាសម្ព័ន្ធទាំងអស់ដែលប្រើសម្រាប់ការវិភាគ Solvent Accessible Surface Area (SASA) ត្រូវបានទទួលពី Protein Data Bank (PDB)52 ឬ AlphaFold Protein Structure Database53។SASA ដាច់ខាតត្រូវបានគណនាសម្រាប់សំណល់នីមួយៗដោយប្រើកម្មវិធី FreeSASA ។មានតែទិន្នន័យ SASA ពេញលេញនិងមិនច្បាស់លាស់សម្រាប់អ៊ីស្ទីឌីនដែលមានស្លាក និងអ្នកជិតខាងរបស់វាប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីទទួលបាន SASA មធ្យមសម្រាប់រចនាសម្ព័ន្ធនីមួយៗ។លទ្ធភាពប្រើប្រាស់សារធាតុរំលាយដែលទាក់ទង (RSA) សម្រាប់ histidine នីមួយៗត្រូវបានគណនាដោយការបែងចែកតម្លៃ SASA ដាច់ខាតដោយផ្ទៃសំណល់អតិបរមាដែលអាចមានជាអតិបរិមាដែលមានសម្រាប់សារធាតុរំលាយ។អ៊ីស្ទីឌីនទាំងអស់ត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ថាលាក់ប្រសិនបើ RSA មធ្យមទាបជាង 20% បើមិនដូច្នេះទេត្រូវបានលាតត្រដាង 56 ។
ឯកសារឆៅដែលទទួលបានក្នុងរបៀប DDA ត្រូវបានស្វែងរកដោយប្រើ Proteome Discoverer (v2.5) ឬ MSfragger (Fragpipe v15.0) នៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ SwissProt សមស្របដែលមានផ្ទុកសារធាតុកខ្វក់ទូទៅ។សារធាតុ peptides ត្រូវការ trypsin ពេញលេញជាមួយនឹងកន្លែងបំបែកពីរដែលបាត់គឺ carbamoyl methylation ជាការកែប្រែថេរ និងការកត់សុី methionine ជាការកែប្រែថាមវន្ត។ភាពធន់នឹងទម្ងន់មុន និងបំណែកត្រូវបានកំណត់ទៅ 10 ppm និង 0.02 Da (MS2 Orbitrap) រៀងគ្នា។ សារធាតុពុលត្រូវបានដកចេញ ហើយប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានត្រងដើម្បីទទួលបានអត្រាការរកឃើញមិនពិត <1%។ សារធាតុពុលត្រូវបានដកចេញ ហើយប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានត្រងដើម្បីទទួលបានអត្រាការរកឃើញមិនពិត <1%។ Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложножно%. ការប៉ះពាល់សារធាតុកខ្វក់ត្រូវបានដកចេញ ហើយប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានត្រងដើម្បីផ្តល់អត្រារកឃើញមិនពិត <1%។去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率។ <1%的错误发现率។ Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных % обнина ការប៉ះពាល់សារធាតុកខ្វក់ត្រូវបានដកចេញ ហើយចម្រោះប្រូតេអ៊ីនដើម្បីសម្រេចបាននូវអត្រាវិជ្ជមានមិនពិត <1%។សម្រាប់ការវិភាគបរិមាណដោយមិនប្រើស្លាក មាតិកាប្រូតេអ៊ីនធម្មតាពីការធ្វើឡើងវិញជីវសាស្រ្តចំនួនបីត្រូវបានគេប្រើ។ការវិភាគការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មកោសិការងប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើការវិភាគហ្សែន Ontology (GO) ពី DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 និងមូលដ្ឋានទិន្នន័យចងក្រង និងបោះពុម្ពដោយក្រុម Alice Ting ។ផែនទីភ្នំភ្លើងទទួលបានពី Perseus (v1.6.15.0) ។ ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់បរិមាណប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានសាកល្បងសម្រាប់សារៈសំខាន់ស្ថិតិដោយប្រើការធ្វើតេស្ត t ពីរចំហៀង ហើយការវាយលុកប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរច្រើនក្រៃលែង>2 (លុះត្រាតែមានចែងផ្សេង) និងតម្លៃ p <0.05។ ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់បរិមាណប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានសាកល្បងសម្រាប់សារៈសំខាន់ស្ថិតិដោយប្រើការធ្វើតេស្ត t ពីរចំហៀង ហើយការវាយលុកប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរច្រើនក្រៃលែង>2 (លុះត្រាតែមានចែងផ្សេង) និងតម្លៃ p <0.05។ Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់មាតិកាប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានសាកល្បងសម្រាប់សារៈសំខាន់ស្ថិតិដោយប្រើតេស្ត t-tailed ពីរ ហើយការផ្គូផ្គងប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរមាតិកា>2 (លុះត្រាតែមានការកត់សម្គាល់ផ្សេង) និងតម្លៃ ap <0.05។使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质员咦的统计显着性，并确定蛋白质员咭的并着陭的02000។使用使用 t 检验检验测试蛋白质倍倍的统计并确定确定命中的的丰度 2 (另有说明) 和ទំ值 <0.05 ។ Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. សារៈសំខាន់ស្ថិតិនៃការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់នៃមាតិកាប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានសាកល្បងដោយប្រើតេស្ត t-tailed ពីរ ហើយការផ្គូផ្គងប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកំណត់សម្រាប់ការផ្លាស់ប្តូរមាតិកា>2 (លុះត្រាតែមានការចង្អុលបង្ហាញ) និង p-values <0.05 ។ការវិភាគអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើការវិភាគ GO រួមជាមួយនឹងមូលដ្ឋានទិន្នន័យខ្សែអក្សរ។
ការចម្លងជីវសាស្ត្រចំនួនបីត្រូវបានអនុវត្តដោយលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ការវិភាគស្ថិតិត្រូវបានធ្វើឡើងជាមួយ GraphPad Prism (កម្មវិធី GraphPad) ហើយផែនការភ្នំភ្លើងត្រូវបានបង្កើតជាមួយ Perseus (v1.6.15.0) ។ដើម្បីប្រៀបធៀបក្រុមទាំងពីរនោះ p-values ត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើ two-tailed Student's t-test។មានតែប្រូតេអ៊ីន singleton ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណយ៉ាងហោចណាស់ពីរដងក្នុងក្រុមពិសោធន៍ត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅក្នុងដីភ្នំភ្លើង ហើយតម្លៃដែលបាត់ដែលត្រូវគ្នានៅក្នុងក្រុមត្រួតពិនិត្យត្រូវបានជំនួសដោយ Perseus ពីការចែកចាយធម្មតា ដូច្នេះតម្លៃ p អាចត្រូវបានគេគណនា។របារកំហុសតំណាងឱ្យគម្លាតមធ្យម ± ស្តង់ដារ។នៅក្នុងការវិភាគ proteomic សម្រាប់ការវិភាគស្ថិតិ ភាពសម្បូរបែបនៃប្រូតេអ៊ីនដែលបានបង្ហាញខ្លួននៅក្នុងការចម្លងជីវសាស្រ្តយ៉ាងហោចណាស់ពីរត្រូវបានរក្សាទុក។វិធីសាស្រ្តស្ថិតិមិនត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់ជាមុនទំហំគំរូទេ។ការពិសោធន៍មិនមែនចៃដន្យទេ។អ្នកស្រាវជ្រាវមិនបានខ្វាក់ភ្នែកចំពោះកិច្ចការក្នុងអំឡុងពេលពិសោធន៍ និងការវាយតម្លៃលទ្ធផលនោះទេ។
សម្រាប់ព័ត៌មានបន្ថែមអំពីការរចនាការសិក្សា សូមមើលរបាយការណ៍ស្រាវជ្រាវធម្មជាតិអរូបីដែលភ្ជាប់ទៅអត្ថបទនេះ។
ទិន្នន័យ spectrometry ដ៏ធំដែលទទួលបានក្នុងការសិក្សានេះត្រូវបានបញ្ជូនទៅ ProteomeXchange Consortium តាមរយៈឃ្លាំងដៃគូ iProX57 នៅក្រោមសំណុំទិន្នន័យលេខសម្គាល់ PXD034811 (សំណុំទិន្នន័យ PDPL-MS) ។ទិន្នន័យឆៅត្រូវបានផ្តល់ជាទម្រង់ឯកសារទិន្នន័យឆៅ។អត្ថបទនេះផ្តល់នូវទិន្នន័យដើម។
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ការស្គាល់តំបន់ជិតខាង៖ ការប្រើ biotinylation អាស្រ័យជិតៗដើម្បីកំណត់លក្ខណៈស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន និងផែនទីសរីរាង្គ។ Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ការស្គាល់តំបន់ជិតខាង៖ ការប្រើ biotinylation អាស្រ័យជិតៗដើម្បីកំណត់លក្ខណៈស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន និងផែនទីសរីរាង្គ។Gingras, AS, Abe, KT និង Raut, B. ភាពស៊ាំជាមួយបរិស្ថានជុំវិញ៖ ការប្រើប្រាស់ biotinylation ដែលពឹងផ្អែកលើភាពជិតៗ ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន និងផែនទីសរីរាង្គ។ Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物嶾绘。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ការយល់ដឹងអំពីសង្កាត់៖ ប្រើប្រាស់ការពឹងផ្អែករបស់សង្កាត់លើជីវិតជីវសាស្រ្ត។Gingras, AS, Abe, KT និង Raut, B. ការយល់ដឹងពីភាពជិតគ្នា៖ លក្ខណៈនៃស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន និងការធ្វើផែនទីនៃសរីរាង្គដោយប្រើប្រាស់ proximity-dependent biotinylation ។នាពេលបច្ចុប្បន្ន។គំនិតរបស់ខ្ញុំ។គីមី។ជីវវិទ្យា ៤៨, ៤៤–៥៤ (ឆ្នាំ ២០១៩)។
Geri, JB et al ។ការធ្វើផែនទីមីក្រូបរិស្ថានដោយផ្ទេរថាមពល Dexter ទៅកោសិកាភាពស៊ាំ។វិទ្យាសាស្រ្ត 367, 1091–1097 (2020)។
Hertling, EL et al ។បណ្តាញមាត្រដ្ឋាន proteome ពីររកឃើញការកែទម្រង់កោសិកាជាក់លាក់នៃអន្តរកម្មរបស់មនុស្ស។ក្រឡា 184, 3022–3040.e3028 (2021)។
ពេលវេលាផ្សាយ៖ ថ្ងៃទី ១៥ ខែកញ្ញា ឆ្នាំ ២០២២
