ព័ត៌មាន

សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។កំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានកម្រិតគាំទ្រ CSS ។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ក្នុងពេលនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្របន្ត យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
កោសិកាមហារីកបានវិវឌ្ឍនូវយន្តការផ្សេងៗដើម្បីជំនះភាពតានតឹងកោសិកា និងបន្តរីកចម្រើន។ប្រូតេអ៊ីន kinase R (PKR) និងប្រូតេអ៊ីនសកម្មរបស់វា (PACT) គឺជាអ្នកឆ្លើយតបដំបូងដែលតាមដានសញ្ញាស្ត្រេសផ្សេងៗដែលនាំទៅដល់ការទប់ស្កាត់ការរីកសាយកោសិកា និង apoptosis ។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ បទប្បញ្ញត្តិនៃផ្លូវ PACT-PKR នៅក្នុងកោសិកាមហារីកនៅតែមិនទាន់ដឹងច្បាស់នៅឡើយ។នៅទីនេះយើងបានរកឃើញថា RNA ដែលមិនសរសេរកូដរយៈពេលយូរ (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ត្រូវបានចូលរួមដោយផ្ទាល់ក្នុងការរារាំងផ្លូវ PACT-PKR និងជំរុញការរីកសាយកោសិកាមហារីក។ដោយប្រើការពិនិត្យមុខងារទ្រង់ទ្រាយធំនៃ CRISPRi 971 ដែលទាក់ទងនឹងជំងឺមហារីក LncRNA យើងបានរកឃើញថា DARS-AS1 ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការរីកសាយកោសិកាមហារីកដែលប្រសើរឡើងយ៉ាងខ្លាំង។ដូច្នេះ ការគោះ DARS-AS1 រារាំងការរីកសាយកោសិកា និងលើកកម្ពស់ការ apoptosis កោសិកាមហារីកនៅក្នុងកោសិកាមហារីកផ្សេងៗនៅក្នុង vitro និងកាត់បន្ថយការលូតលាស់ដុំសាច់នៅក្នុង vivo យ៉ាងខ្លាំង។តាមមេកានិច DARS-AS1 ភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅដែនសកម្ម PACT និងការពារអន្តរកម្ម PACT-PKR ដោយហេតុនេះកាត់បន្ថយការធ្វើឱ្យសកម្ម PKR, eIF2α phosphorylation និងរារាំងការស្លាប់កោសិកា apoptotic ។តាមគ្លីនិក DARS-AS1 ត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងជំងឺមហារីកជាច្រើន ហើយការបង្ហាញជ្រុលនៃ lncRNA នេះគឺបង្ហាញពីការព្យាករណ៍មិនល្អ។ការសិក្សានេះពន្យល់ពីបទប្បញ្ញត្តិជាក់លាក់នៃជំងឺមហារីកនៃផ្លូវ PACT-PKR ដោយ DARS-AS1 lncRNA និងផ្តល់នូវគោលដៅមួយផ្សេងទៀតសម្រាប់ការព្យាករណ៍ និងការព្យាបាលជំងឺមហារីក។
សមត្ថភាពក្នុងការសម្របខ្លួនទៅនឹងភាពតានតឹងគឺជាលក្ខណៈសំខាន់នៃការរស់រានមានជីវិត និងការរីកសាយនៃកោសិកាមហារីក។ការរីកសាយភាយយ៉ាងឆាប់រហ័ស និងលក្ខណៈមេតាបូលីសនៃជំងឺមហារីកបានឈានដល់កម្រិតកំពូលនៅក្នុងបរិយាកាសដ៏អាក្រក់ - កង្វះសារធាតុចិញ្ចឹម ការថយចុះជាតិស្ករក្នុងឈាម និង pH ទាប - ដែលអាចបង្កឱ្យមានផ្លូវនៃការស្លាប់កោសិកា។ភាពមិនប្រក្រតីនៃហ្សែនដែលងាយនឹងស្ត្រេសដូចជា p535 ប្រូតេអ៊ីនឆក់កំដៅ 6, 7, KRAS8, 9, និង HIF-110, 11, 12, 13 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញជាញឹកញាប់នៅក្នុងជំងឺមហារីក ដោយហេតុនេះរារាំង apoptosis និងលើកកម្ពស់ការរស់រានមានជីវិត។
ប្រូតេអ៊ីន kinase R (PKR) គឺជាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាស្ត្រេសដ៏សំខាន់មួយ និងជាអនុunit kinase នៃកត្តាចាប់ផ្តើម eukaryotic 2α (eIF2α) ដែលជានិយតករបកប្រែដែលភ្ជាប់ភាពតានតឹងកោសិកាទៅនឹងការស្លាប់កោសិកា។PKR ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដំបូងថាជាប្រូតេអ៊ីនប្រឆាំងមេរោគដោយការរកឃើញនៃ RNA ពីរខ្សែបរទេស (dsRNA) ។នៅពេលធ្វើឱ្យសកម្ម PKR phosphorylates eIF2α ដើម្បីរារាំងការសំយោគប្រូតេអ៊ីនមេរោគ និងកោសិកា14,15,16។PACT (PKR activator protein) ត្រូវបានកំណត់ថាជាប្រូតេអ៊ីនសកម្ម PKR ដំបូងបង្អស់ដែលមិនមាន dsRNA17,18,19,20,21,22,23។តាមរយៈអន្តរកម្មដោយផ្ទាល់ជាមួយ PKR PACT បញ្ជូនភាពតានតឹងផ្សេងៗ (ការអត់ឃ្លានសេរ៉ូម សារធាតុ peroxide ឬការព្យាបាលអាសេនីត) ទៅជា PKR និងផ្លូវបញ្ជូនសញ្ញាចុះក្រោម។បន្ថែមពីលើ eIF2α phosphorylation ការធ្វើឱ្យសកម្ម PKR ដែលសម្របសម្រួលដោយ PACT បង្កឱ្យមានព្រឹត្តិការណ៍ផ្សេងៗដែលទាក់ទងនឹងការឆ្លើយតបស្ត្រេស រួមទាំងស្ថានភាព redox ដែលត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរតាមរយៈផ្លូវ PI3K/Akt24 ការត្រួតពិនិត្យការខូចខាត DNA ដែលប្រសើរឡើងតាមរយៈ p5325,26 និង NF-κB27,28 និយ័តកម្មប្រតិចារិក, 29 ។ ដោយសារតួនាទីសំខាន់របស់ពួកគេក្នុងការឆ្លើយតបស្ត្រេស ការរីកសាយ ជំងឺ apoptosis និងដំណើរការកោសិកាសំខាន់ៗផ្សេងទៀត PKR និង PACT កំពុងសន្យាថាជាគោលដៅព្យាបាលសម្រាប់ជំងឺជាច្រើន ជាពិសេសមហារីក 30,31,32,33។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទោះបីជាសារៈសំខាន់នៃមុខងារ និងជីវសាស្ត្រ pleiotropic នេះក៏ដោយ ក៏បទប្បញ្ញត្តិនៃសកម្មភាព PACT/PKR នៅក្នុងកោសិកាមហារីកនៅតែពិបាកយល់។
lncRNAs គឺជាប្រតិចារិកធំជាង 200 nucleotides ដែលមិនមានសក្តានុពលកូដប្រូតេអ៊ីន។ចាប់តាំងពីគម្រោងលំដាប់ហ្សែនទាំងមូលដែលទំនើបបំផុតបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ LncRNAs រាប់ពាន់ 35,36 ការខិតខំប្រឹងប្រែងជាច្រើនត្រូវបានធ្វើឡើងដើម្បីបំភ្លឺមុខងារជីវសាស្រ្តរបស់ពួកគេ។ការរីកលូតលាស់នៃការស្រាវជ្រាវបានបង្ហាញថា lncRNAs ត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងដំណើរការជីវសាស្រ្តជាច្រើន រួមទាំងបទប្បញ្ញត្តិនៃ X-chromosome inactivation38,39, imprinting40, transcription41,42, translation43 និងសូម្បីតែការរីកលូតលាស់នៃជំងឺមហារីក44,45,46,47។ការសិក្សាទាំងនេះបានរាយការណ៍ថា lncRNAs ជាច្រើនត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងផ្លូវ PACT/PKR ។ការសិក្សាមួយបែបនេះបានបង្ហាញថា lncRNA ASPACT រារាំងការចម្លង PACT និងបង្កើនការរក្សានុយក្លេអ៊ែរនៃ PACT mRNA ។ការសិក្សាផ្សេងទៀតបានបង្ហាញថា lncRNA nc886 ភ្ជាប់ទៅនឹង PKR និងរារាំង phosphorylation របស់វា 49,50 ។រហូតមកដល់ពេលនេះ lncRNA គ្រប់គ្រងការធ្វើឱ្យសកម្ម PKR ដែលសម្របសម្រួលដោយ PACT មិនត្រូវបានគេរាយការណ៍ទេ។
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ត្រូវបានគេកំណត់ថាជា oncogenic lncRNA51,52,53,54 ។តាមរយៈបទប្បញ្ញត្តិនៃ miP-194-5p53, miP-12952 និង miP-532-3p51, DARS-AS1 ត្រូវបានបង្ហាញដើម្បីជំរុញការលូតលាស់នៃកោសិកាមហារីកតម្រងនោមកោសិកាច្បាស់លាស់ មហារីកក្រពេញទីរ៉ូអ៊ីត និងមហារីកសួតកោសិកាមិនតូចរៀងៗខ្លួន។តុង និងសហការីក៏បានរកឃើញថា DARS-AS1 ជំរុញការវិវត្តនៃ myeloma ដោយរក្សាស្ថេរភាពនៃប្រូតេអ៊ីន 39 (RBM39) RNA-binding motif ។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មិនមានការសិក្សាណាមួយត្រូវបានធ្វើឡើងថាតើ lncRNA នេះពាក់ព័ន្ធនឹងបទប្បញ្ញត្តិនៃការធ្វើឱ្យសកម្ម PACT-PKR និងការឆ្លើយតបស្ត្រេសនៃកោសិកាមហារីកនោះទេ។
នៅទីនេះ យើងបានអនុវត្តអេក្រង់បាត់បង់មុខងារដ៏ធំដោយប្រើប្រព័ន្ធ CRISPRi ហើយបានកំណត់ថា DARS-AS1 lncRNA ជំរុញការរីកសាយនៃកោសិកាមហារីកជាច្រើនប្រភេទ។លើសពីនេះ យើងបានកំណត់នូវយន្តការសំខាន់មួយ៖ DARS-AS1 ភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅនឹង PACT រារាំងការចង PACT និង PKR ការពារ phosphorylation នៃ eIF2α ដែលជាស្រទាប់ខាងក្រោម PKR ហើយទីបំផុតរារាំងការស្លាប់កោសិកា apoptotic ។សរុបសេចក្តី ការងាររបស់យើងបង្ហាញពី DARS-AS1 lncRNA ជានិយតករនៃផ្លូវ PACT-PKR និងជាគោលដៅសក្តានុពលសម្រាប់ការព្យាបាល និងការព្យាករណ៍មហារីក។
ការសិក្សាស្រាវជ្រាវហ្សែនយ៉ាងទូលំទូលាយបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ LncRNAs រាប់រយដែលទាក់ទងនឹងជំងឺមហារីក។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយមុខងាររបស់ពួកគេនៅតែមិនស្គាល់ 56 ។ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណបេក្ខជន lncRNA ដែលកំពុងជាប់ពាក់ព័ន្ធក្នុងការវិវត្តនៃជំងឺមហារីក យើងបានអនុវត្តអេក្រង់បាត់បង់មុខងារសម្រាប់កាត់បន្ថយការរីកសាយនៅក្នុងខ្សែកោសិកាមហារីកពោះវៀនធំ SW620 ដោយប្រើប្រព័ន្ធ CRISPRi (រូបភាព 1a)។លក្ខណៈពិសេសតែមួយគត់នៃខ្សែកោសិកាមហារីកពោះវៀនធំ SW480 និង SW620 គឺថាពួកវាកើតចេញពីដុំសាច់បឋម និងបន្ទាប់បន្សំក្នុងអ្នកជំងឺតែមួយ។នេះផ្តល់នូវការប្រៀបធៀបដ៏មានតម្លៃសម្រាប់សិក្សាការផ្លាស់ប្តូរហ្សែនក្នុងការវិវត្តនៃជំងឺមហារីកពោះវៀនធំ។ដូច្នេះហើយ យើងបានវិភាគប្រតិចារិកនៃខ្សែកោសិកាមហារីកពោះវៀនធំ (SW480 និង SW620) ដោយប្រើលំដាប់ RNA និងបានប្រមូល LncRNAs មុខងារសក្តានុពលមួយចំនួនពីអក្សរសិល្ប៍ដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយ។ដោយផ្អែកលើលទ្ធផលទាំងនេះ យើងបានរចនាបណ្ណាល័យ sgRNA រួមបញ្ចូលគ្នាដែលមាន 7355 sgRNA oligos ផ្តោតលើ lncRNAs ទាក់ទងនឹងជំងឺមហារីក 971 និង 500 sgRNA oligos ដែលមិនបានកំណត់គោលដៅសម្រាប់ការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន (ទិន្នន័យបន្ថែម 1) ។
ការបង្ហាញគ្រោងការណ៍នៃការបញ្ចាំងដោយប្រើប្រព័ន្ធ CRISPRi ។b sgRNA enrichment បន្ទាប់ពីការពិនិត្យ។បន្ទាត់ចំនុចផ្ដេកតំណាងឱ្យ log2 (ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់) = ± 0.58 ។បន្ទាត់ចំនុចបញ្ឈរបង្ហាញពីតម្លៃ p = 0.05 ។ចំណុចខ្មៅតំណាងឱ្យ sgRNA មិនមែនគោលដៅ (កំណត់ថាជា NC)។ចំណុចក្រហមគឺ sgRNAs កំណត់គោលដៅ DARS-AS1។ចំណុចពណ៌ខៀវគឺជា sgRNAs កំណត់គោលដៅ LINC00205 ដែលជា lncRNA oncogenic ដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។fold change = (ការអានធម្មតា ថ្ងៃទី 17)/(ការអានធម្មតា ថ្ងៃទី 0)។c DARS-AS1 sgRNA knockdown រារាំងការលូតលាស់កោសិកា។របារកំហុសតំណាងឱ្យ±គម្លាតស្តង់ដារនៃការពិសោធន៍ទាំងបី។* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 two-tailed Student's t-test.d កន្សោម DARS-AS1 នៅក្នុងដុំសាច់ (សំណុំទិន្នន័យ TCGA) ។em ការបង្ហាញនៃ DARS-AS1 នៅក្នុងគំរូធម្មតា និងដុំសាច់ជាគូពីអ្នកជំងឺដែលមាន BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, និង COAD រៀងគ្នា (សំណុំទិន្នន័យ TCGA) ។p-values ​​ត្រូវបានគេទទួលបានដោយប្រើ t-test របស់សិស្សដែលមានកន្ទុយពីរ។
បន្ទាប់ពីបង្កើត plasmid និងវេចខ្ចប់ lentivirus យើងបានចម្លងកោសិកាមហារីកពោះវៀនធំ dCas9-SW620 ជាមួយនឹងបណ្ណាល័យខាងលើនៅក្នុងការពិសោធន៍ឆ្លងឯករាជ្យចំនួនបួន។ភាពច្រើននៃការឆ្លងមេរោគ (MOI) សម្រាប់ការឆ្លងទាំងនេះគឺ 0.1-0.3 ដែលបង្ហាញថាកោសិកានីមួយៗអាចឆ្លងបានតែជាមួយ sgRNA មួយប៉ុណ្ណោះ។បន្ទាប់ពីរយៈពេល 18 ថ្ងៃនៃវប្បធម៍នៅក្នុង vitro ទម្រង់ការពង្រឹងនៃ sgRNAs គោលដៅបានថយចុះ ឬកើនឡើងបន្ទាប់ពីការពិនិត្យ ខណៈពេលដែលចំនួននៃ oligonucleotides វត្ថុបញ្ជាដែលមិនមានគោលដៅនៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរបើប្រៀបធៀបទៅនឹងទម្រង់មុនការបញ្ចាំង ដែលបង្ហាញថាគោលដៅរបស់យើងមានអេក្រង់ជាក់លាក់ខ្ពស់ បណ្ណាល័យ។អង្ករ។1b និងតារាងបន្ថែម 1). LINC00205 ដែលត្រូវបានរាយការណ៍ពីមុនដើម្បីលើកកម្ពស់ជំងឺមហារីកសួត និងការវិវត្តនៃជំងឺមហារីកថ្លើម 58,59,60 ត្រូវបានពិនិត្យចេញ (log2 (ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់) < −0.58, p តម្លៃ < 0.05) ដោយបញ្ជាក់ពីភាពជឿជាក់នៃការពិនិត្យនេះ (រូបភាព 1b)។ LINC00205 ដែលត្រូវបានរាយការណ៍ពីមុនដើម្បីលើកកម្ពស់ជំងឺមហារីកសួត និងការវិវត្តនៃជំងឺមហារីកថ្លើម 58,59,60 ត្រូវបានពិនិត្យចេញ (log2 (ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់) < −0.58, p តម្លៃ < 0.05) ដោយបញ្ជាក់ពីភាពជឿជាក់នៃការពិនិត្យនេះ (រូបភាព 1b)។ LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .១ខ). LINC00205 ដែលបានរាយការណ៍ពីមុនដើម្បីលើកកម្ពស់ការវិវត្តនៃជំងឺមហារីកសួត និងមហារីកថ្លើម 58,59,60 ត្រូវបានដកចេញ (log2 (ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់) <-0.58, p-value <0.05) ដោយបញ្ជាក់ពីភាពរឹងមាំនៃការពិនិត្យនេះ (រូបភាព .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 前进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 国道枏）< 园国 姭可囀姭国 1.0.5) LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 前进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 国道枏）< 园国 姭可囀姭国 1.0.5) LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .១ខ). LINC00205 ដែលបានរាយការណ៍ពីមុនដើម្បីលើកកម្ពស់ការវិវត្តនៃជំងឺមហារីកសួត និងថ្លើម 58,59,60 ត្រូវបានដកចេញ (log2 (ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់) <-0.58, p-value <0.05) ដោយបញ្ជាក់ពីភាពរឹងមាំនៃការពិនិត្យនេះ (រូបភាព .1b)។
ក្នុងចំណោម lncRNAs ទាំងអស់ដែលត្រូវបានធ្វើតេស្ត DARS-AS1 ក៏ត្រូវបានពិនិត្យផងដែរ ដោយសារធាតុ sgRNA oligonucleotides ទាំងបីត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងបន្ទាប់ពីរយៈពេល 18 ថ្ងៃនៃវប្បធម៌ ដែលបង្ហាញថាការដួលរលំនៃ lncRNA នេះបណ្តាលឱ្យកាត់បន្ថយការរីកសាយនៃជំងឺមហារីក (រូបភាព 1b) ។លទ្ធផលនេះត្រូវបានគាំទ្របន្ថែមទៀតដោយការវិភាគ MTS នៅក្នុងកោសិកាមហារីកពោះវៀនធំដែលបង្ហាញថាអត្រាកំណើននៃកោសិការធ្លាក់ DARS-AS1 ត្រូវបានកាត់បន្ថយត្រឹមតែពាក់កណ្តាលបើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាគ្រប់គ្រង (រូបភាពទី 1c) ហើយស្របនឹងរបាយការណ៍មុននៃប្រភេទមហារីកផ្សេងៗទៀត។: មហារីកតម្រងនោមកោសិកាច្បាស់លាស់ មហារីកក្រពេញទីរ៉ូអ៊ីត និងមហារីកសួតកោសិកាមិនតូច 51,52,53,55។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មុខងារ និងយន្តការម៉ូលេគុលរបស់វានៅក្នុងជំងឺមហារីកពោះវៀនធំនៅតែមិនទាន់ត្រូវបានរុករកនៅឡើយ។ដូច្នេះហើយ យើងជ្រើសរើស lncRNA នេះសម្រាប់ការសិក្សាបន្ថែម។
ដើម្បីសិក្សាការបញ្ចេញមតិ DARS-AS1 ចំពោះអ្នកជំងឺ យើងបានវិភាគយ៉ាងទូលំទូលាយនូវគំរូដុំសាច់ចំនួន 10,327 ពីគម្រោង Cancer Genome Atlas (TCGA) ។លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា DARS-AS1 ត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងទូលំទូលាយ និងត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុងកោសិកាដែលមានសុខភាពល្អនៅក្នុងប្រភេទដុំសាច់ជាច្រើន រួមទាំងមហារីកពោះវៀនធំ (COAD) មហារីកកោសិកាដែលសម្អាតតម្រងនោម (KIRC) និងមហារីកកោសិកា papillary cell carcinoma (KIRP)។.តិចតួចណាស់ (រូបភាពទី 1 ឃ និងបន្ថែម រូបភព 1a, ខ) ។ ការវិភាគលើសំណាកដុំសាច់ដែលមានសុខភាពល្អជាគូបានបញ្ជាក់ពីការបង្ហាញកាន់តែខ្ពស់នៃ DARS-AS1 នៅក្នុងដុំសាច់មហារីកប្លោកនោម urothelial carcinoma (BLCA), មហារីកតម្រងនោមក្រលៀនជម្រះកោសិកាមហារីក (KIRC), មហារីកក្រពេញប្រូស្តាត adenocarcinoma (PRAD), មហារីកកោសិកាមហារីកសួត (LUSC) ។ មហារីកស្បូន endometrial carcinoma (UCEC) មហារីកសួត adenocarcinoma (LUAD) មហារីកថ្លើមថ្លើម (LIHC) មហារីកតំរងនោម papillary cell carcinoma (KIRP) និង colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (រូបភាព 1e–m) . ការវិភាគលើសំណាកដុំសាច់ដែលមានសុខភាពល្អជាគូបានបញ្ជាក់ពីការបង្ហាញកាន់តែខ្ពស់នៃ DARS-AS1 នៅក្នុងដុំសាច់មហារីកប្លោកនោម urothelial carcinoma (BLCA), មហារីកតម្រងនោមក្រលៀនជម្រះកោសិកាមហារីក (KIRC), មហារីកក្រពេញប្រូស្តាត adenocarcinoma (PRAD), មហារីកកោសិកាមហារីកសួត (LUSC) ។ មហារីកស្បូន endometrial carcinoma (UCEC) មហារីកសួត adenocarcinoma (LUAD) មហារីកថ្លើមថ្លើម (LIHC) មហារីកតំរងនោម papillary cell carcinoma (KIRP) និង colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (រូបភាព 1e–m) .ការវិភាគលើសំណាកដុំសាច់ដែលមានសុខភាពល្អជាគូក៏បានបញ្ជាក់ពីការបង្ហាញកាន់តែខ្ពស់នៃ DARS-AS1 នៅក្នុងមហារីកប្លោកនោម urothelial carcinoma (BLCA), មហារីកតំរងនោម និងកោសិកាតំរងនោមច្បាស់លាស់ (KIRC), មហារីកក្រពេញប្រូស្តាត adenocarcinoma (PRAD), ដុំសាច់មហារីកសួត squamous cell carcinoma (LUSC) ។, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– ម) ។ , មហារីកស្បូន endometrial នៃ corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma នៃសួត (LUAD), មហារីកថ្លើមថ្លើម (LIHC), មហារីកកោសិកា papillary នៃតម្រងនោម (KIRP) និង adenocarcinoma នៃពោះវៀនធំ (COAD) (p តម្លៃ < 0.05) (រូប 1e–m) ។配对 / 肿瘤样本肿瘤样本的分析了进一步证实了了 dars-‧在膀胱尿路皮癌 (BLCA), 肾肾细胞癌 (Kirc), 前列腺腺癌 (Prad), 肺鳞状细胞癌 (LUSC) 肿瘤中的显着更高表达，子宫体子宫 的更多内容<0.05) (图1e-m) ។配配 / 健康 / 肿瘤样本分析证实了了 dars-了了上上上上皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌前列腺腺癌腺腺癌腺腺癌 (Prad), 细胞癌细胞癌(LUSC) 肿瘤的的的的的中中中中中中中显着更表达表达表达表达表达 (ucent) 肺腺癌 (Luad) 肝肝 (Luad) 肝肝细胞癌 (lihc (lihc) 肾乳头状乳头状乳头状癌 (kirp) (coad) (p 值<0.05) (图1e-m) ។ការវិភាគលើសំណាកដែលមានសុខភាពល្អ/ដុំសាច់បានគាំទ្របន្ថែមលើតួនាទីរបស់ DARS-AS1 ក្នុងមហារីកប្លោកនោម urothelial carcinoma (BLCA), មហារីកកោសិកាតំរងនោមច្បាស់លាស់ (KIRC), មហារីកក្រពេញប្រូស្តាត adenocarcinoma (PRAD) និងដុំសាច់មហារីកកោសិកាមហារីកសួត (LUSC) ។экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e - ម) ។ ការបង្ហាញនៅក្នុង corpus uterine carcinoma (UCEC), សួត adenocarcinoma (LUAD), មហារីកថ្លើម (LIHC), renal papillary cell carcinoma (KIRP) និង colon adenocarcinoma (COAD) (p តម្លៃ <0.05) (រូបភាព 1e -m) ។សរុបមក លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា DARS-AS1 ត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងទូលំទូលាយ និងខ្ពស់ចំពោះជំងឺមហារីកផ្សេងៗ។
ដោយសារតែ DARS-AS1 និង DARS (ហ្សែនដែលបានអ៊ិនកូដខ្សែ antisense) ចែករំលែកអ្នកផ្សព្វផ្សាយដូចគ្នា ហើយមានទីតាំងនៅជាប់គ្នា យើងបានរចនា shRNA ដើម្បីកាត់បន្ថយជាពិសេស DARS-AS1 ប៉ុន្តែមិនមែន DARS (រូបភាពបន្ថែម 2a, b និងតារាងបន្ថែម 2) .បន្ថែមពីលើ SW620 យើងក៏បានប្រើបន្ទាត់កោសិកាចំនួនបីផ្សេងទៀតដែលបង្ហាញពី DARS-AS1 យ៉ាងខ្លាំង ដើម្បីសិក្សាពីប្រសិទ្ធភាព និងមុខងារនៃការទម្លាក់ shRNA (តារាងបន្ថែម 3)។លទ្ធផលរបស់យើងបានបង្ហាញថា shRNAs ទាំងបីដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងសម្រេចបានយ៉ាងតិច 80% ប្រសិទ្ធភាពធ្លាក់ចុះ DARS-AS1 ជាមួយនឹងឥទ្ធិពលតិចតួចលើបរិមាណ DARS mRNA (រូបភាពបន្ថែម 2c–f) ។លើសពីនេះទៀត យើងបានរកឃើញថា DARS-AS1 ធ្លាក់ចុះជាមួយនឹង shRNAs ទាំងនេះយ៉ាងសំខាន់រារាំងការលូតលាស់កោសិកានៅក្នុងកោសិកាមហារីកពោះវៀនធំ SW620 (49.7%) និង HCT116 (27.7%) ខ្សែកោសិកាមហារីកសុដន់ MBA-MD-231 (53.4%) ។) និងបន្ទាត់កោសិកា hepatoma HepG2 (កាត់បន្ថយ 92.7%) ក៏ដូចជាសមត្ថភាពរបស់ពួកគេក្នុងការបង្កើតជាលំហដែលមិនបានបោះចោល (ការកាត់បន្ថយជាមធ្យម ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% និង 75.7% ក្នុងមួយជួរកោសិកា) (រូបភាព 2a, ខ) ។នៅក្នុង SW620 លទ្ធផលនៃការវិភាគនៃការបង្កើតអាណានិគមបានបញ្ជាក់បន្ថែមថា DARS-AS1 shRNA បានរារាំងការរីកសាយកោសិកាយ៉ាងខ្លាំងជាមួយនឹងការថយចុះជាមធ្យមប្រហែល 69.6% (រូបភាព 2c) ។
ឥទ្ធិពលនៃការគ្រប់គ្រង shRNA និង DARS-AS1 shRNA លើការរីកសាយកោសិកា (a) និងការបង្កើត spheroid (b) នៅក្នុងកោសិកា SW620, HCT116, MBA-MD-231 និង HepG2 ។c ឥទ្ធិពលនៃការគ្រប់គ្រង shRNA និង DARS-AS1 shRNA លើការបង្កើតអាណានិគមនៅក្នុងកោសិកា SW620 ។ការរីកសាយកោសិកា (d) ការបង្កើត spheroid (e) និងការបង្កើតអាណានិគម (f) នៃកោសិកា SW620 ដែលបង្ហាញលើសទម្ងន់ DARS-AS1។ទិន្នន័យ​ដែល​បាន​បង្ហាញ​គឺ​ជា​មធ្យម ± គម្លាត​ស្តង់ដារ​នៃ​ការ​ពិសោធន៍​បី។* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 និង *** p ≤ 0.001 ដោយ t-test របស់សិស្សដែលមានកន្ទុយពីរ។
ដើម្បីបំពេញបន្ថែមការសិក្សាអំពីការបាត់បង់មុខងារ យើងបានបង្កើតកោសិកា SW620 ដែលបង្ហាញលើសទម្ងន់ DARS-AS1 (រូបភាពបន្ថែម 2g)។ការបង្ហាញហួសហេតុ DARS-AS1 បានបង្កើនការលូតលាស់កោសិកាយ៉ាងខ្លាំង (1.8 ដង) ការបង្កើត spheroid ដែលមិនស្ថិតស្ថេរ (1.4 ដង) និងការបង្កើតអាណានិគម (3.3 ដង) នៅក្នុងកោសិកា SW620 (រូបភាព 2d-f) ។យើង​បាន​បញ្ជាក់​លទ្ធផល​នេះ​ដោយ​ប្រើ​បន្ទាត់​កោសិកា​បង្ហាញ DARS-AS1 ផ្សេង​ទៀត A549។ការរីកសាយកោសិកាដែលប្រសើរឡើងនេះដោយសារការហួសប្រមាណ DARS-AS1 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញបន្ថែមទៀតនៅក្នុងកោសិកា A549 (រូបភាពបន្ថែម 2h, i និងតារាងបន្ថែម 3)។សរុបមក ការសិក្សាចំណេញ និងខាតទាំងនេះបង្ហាញថា DARS-AS1 ជំរុញការរីកសាយកោសិកាមហារីកនៅក្នុង vitro ។
ដើម្បីស្វែងយល់ពីយន្តការមូលដ្ឋានដែល DARS-AS1 គ្រប់គ្រងការរីកសាយកោសិកា យើងបានធ្វើការវិភាគទាញចុះក្រោម RNA ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណដៃគូដែលមានសក្តានុពលនៃប្រូតេអ៊ីនរបស់វា។លទ្ធផល RT-qPCR បានបង្ហាញថាប្រហែល 86.2% នៃ DARS-AS1 ស្ថិតនៅក្នុង cytoplasm នៃកោសិកា SW620 (រូបភាពបន្ថែម 3a) ។បន្ទាប់​មក កោសិកា​ដែល​បាន​ចម្លង​តាម​ប្រព័ន្ធ​អ៊ីនធឺណែត DARS-AS1 ឬ pseudoRNA ត្រូវ​បាន​បង្កើត​ដោយ​កោសិកា SW620 ដែល​បន្ត​ដោយ​ការ​បំបែក SDS-PAGE ។ស្នាមប្រឡាក់ប្រាក់ជាបន្តបន្ទាប់បានបង្ហាញថាក្រុមតន្រ្តីដាច់ដោយឡែក (~38 kDa) ត្រូវបានពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងគំរូទាញ DARS-AS1 ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុងគំរូ RNA ឬអង្កាំទេ (រូបភាព 3a) ។ក្រុមនេះត្រូវបានកំណត់ថាជា PKR activating protein (PACT) ដោយវិសាលគមធំ (MS) និងបញ្ជាក់បន្ថែមដោយ immunoblotting នៅក្នុង SW620, HCT116, និង HepG2 cell line (រូបភាព 3a,b)។ការពង្រឹងនៃ DARS និងប្រូតេអ៊ីន PACT ដែលពាក់ព័ន្ធ - PKR និង TRBP - ក៏ត្រូវបានស៊ើបអង្កេតដោយប្រើការវិភាគ RNA ដោយ Western blotting (WB) ។លទ្ធផលបានបង្ហាញថាគ្មានអន្តរកម្មផ្ទាល់រវាង DARS-AS1 RNA និងប្រូតេអ៊ីនទាំងបីនេះត្រូវបានរកឃើញទេ (រូបភាពបន្ថែម 3b)។អន្តរកម្មជាក់លាក់រវាង DARS-AS1 និង PACT ត្រូវបានបញ្ជាក់បន្ថែមដោយការវិភាគ RNA immunoprecipitation (RIP) ដែលបង្ហាញថា DARS-AS1 ត្រូវបានពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងអង្គបដិបក្ខប្រឆាំងនឹង PACT ប៉ុន្តែមិនមែន RNAs គ្រប់គ្រងផ្សេងទៀតទេ (រូបភាព 3c) ។ដើម្បីកំណត់ថាតើ DARS-AS1 មានអន្តរកម្មដោយផ្ទាល់ជាមួយ PACT ក្នុងករណីដែលមិនមានសមាសធាតុកោសិកាផ្សេងទៀតទេ ការវិភាគ in vitro biolayer interferometry (BLI) ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ PACT បន្សុត។Biotin-labeled DARS-AS1 ឬអត់ចេះសោះ RNA ត្រូវបានគេដាក់នៅលើ biosensors streptavidin (SA) ហើយបន្ទាប់មក incubed នៅក្នុង kinetic buffer ដែលមាន 1 μM PACT ។គួរកត់សម្គាល់ថា PACT បានចងភ្ជាប់យ៉ាងខ្លាំងទៅនឹង DARS-AS1 (តម្លៃ KD ~26.9 nM) ប៉ុន្តែមិនមែនដើម្បីធ្វើត្រាប់តាម RNA (រូបភាពទី 3d) នោះទេ។រួមគ្នា លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញពីអន្តរកម្មផ្ទាល់ និងទំនាក់ទំនងខ្ពស់រវាង DARS-AS1 និង PACT ។
ការវិភាគទាញ RNA បានកំណត់អត្តសញ្ញាណ DARS-AS1 អន្តរកម្មជាមួយ PACT នៅក្នុងកោសិកា SW620 ។ខាងលើស្នាមប្រឡាក់ប្រាក់នៃប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធ។ការចាក់ថ្នាំ immunoblot ទាបត្រូវបានអនុវត្តជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង PACT ។b ការវិភាគទាញចុះ RNA ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងកោសិកា HCT116 (ខាងលើ) និង HepG2 (ខាងក្រោម) ។ការពង្រឹង PACT ត្រូវបានរកឃើញដោយ immunoblotting ។ការធ្វើតេស្ត cRNA immunoprecipitation (RIP) ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងកោសិកា SW620 ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។d PACT ចងខ្សែកោងទៅនឹងប្រវែងពេញ DARS-AS1 ឬ RNA គ្រប់គ្រងត្រូវបានទទួលដោយប្រើ biolayer interferometry (BLI) ។RNA ត្រូវបាន immobilized នៅលើ streptavidin biosensor ។1 μM PACT ត្រូវបានប្រើដើម្បីវាស់ស្ទង់ទំនាក់ទំនង។e RNA pull assay ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ biotinylated full-length DARS-AS1 ឬកាត់ឱ្យខ្លី (ខាងលើ)។Immunoblot បង្ហាញ PACT បានទទួល (បាត) ។f PACT ដែលមានទង់ជាតិដែលបានបន្សុតត្រូវបាន incubated ជាមួយ biotinylated ប្រវែងពេញលេញ DARS-AS1 ឬកាត់ (ដូចនៅក្នុង e) សម្រាប់ការវិភាគ in vitro RIP ។RNA ស្រង់ចេញត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយ RT-qPCR ។g ភាពស្និទ្ធស្នាលដែលទាក់ទងនៃបំណែក RNA ផ្សេងគ្នាសម្រាប់ PACT ត្រូវបានទទួលដោយប្រើ biolayer interferometry ។សម្រាប់ការវិភាគ 100 nM RNA និង 1 μM RAST ត្រូវបានប្រើប្រាស់។h ការវិភាគក្នុង vitro RIP ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ PACT ដែលបន្សុតនៅដដែល ឬកាត់ឱ្យខ្លី។RNA ស្រង់ចេញត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយ RT-qPCR ។i អត្រាកំណើននៃកោសិកា SW620 ហួសប្រមាណ DARS-AS1, PACT ឬទាំងពីរ។j ការបង្ហាញហួសប្រមាណនៃប្រវែងពេញ ឬកាត់ខ្លី DARS-AS1 នៅក្នុងកោសិកា SW620 មានឥទ្ធិពលខុសៗគ្នាលើការលូតលាស់កោសិកា។k Apoptosis ត្រូវបានរកឃើញដោយ immunoblotting ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង PARP ។l Knockout នៃ DARS-AS1 បណ្តាលឱ្យ apoptosis នៃកោសិកា SW620 ដូចដែលបានបង្ហាញដោយ flow cytometry ។ទិន្នន័យ​ដែល​បាន​បង្ហាញ​គឺ​ជា​មធ្យម ± គម្លាត​ស្តង់ដារ​នៃ​ការ​ពិសោធន៍​បី។ *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ដោយការធ្វើតេស្តរបស់សិស្សកន្ទុយពីរ។ *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ដោយការធ្វើតេស្តរបស់សិស្សកន្ទុយពីរ។ *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента ។ *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ដោយ t-test របស់សិស្សដែលមានកន្ទុយពីរ។ *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验។ *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验។ *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента ។ *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ដោយ t-test របស់សិស្សដែលមានកន្ទុយពីរ។
បន្ទាប់មកយើងបានបង្កើតបំណែក DARS-AS1 RNA ដែលធ្វើ biotinylated ចំនួនបីដោយការចម្លងនៅក្នុង vitro ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណតំបន់ DARS-AS1 ដែលត្រូវការសម្រាប់សមាគម PACT (រូបភាព 3e) ។លទ្ធផលនៃការវិភាគ RNA បានបង្ហាញថាបំណែកនីមួយៗអាចធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ PACT ប៉ុន្តែតំបន់ 3′-terminal (384–768 nucleotides ដែលមានស្លាក A3) បានបង្ហាញច្រើនជាង 1–384 nucleotides ដែលមានស្លាក A1) (រូបភាព 3e)។លទ្ធផលស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងការវិភាគ in vitro RIP ដោយប្រើ PACT ផ្សំឡើងវិញ (រូបភាពទី 3f) ។ដោយអនុលោមតាមលទ្ធផលទាំងនេះ ការពិសោធន៍ដើម្បីចងបំណែក RNA immobilized ទៅ PACT ដោយប្រើ BLI ក៏បានបង្ហាញថា PACT មានទំនាក់ទំនងខ្ពស់ជាងសម្រាប់ A3 (384–768 nt) (តម្លៃ KD ប្រហែល 94.6 nM) ខណៈពេលដែលស្ទើរតែគ្មានតំណភ្ជាប់ជាមួយតំបន់ផ្សេងទៀត។(រូបទី 3 ឃ) ។
យើងក៏បានពិនិត្យមើលតំបន់ចងភ្ជាប់ដែលពាក់ព័ន្ធនៅក្នុង PACT ផងដែរ។PACT មានដែនមុខងារបី ដែលពីរត្រូវបានអភិរក្ស ដែនភ្ជាប់ RNA ពីរជាន់ (dsRBD) និងដែនទីបី (កំណត់ D3) ដែលដើរតួជាអ្នកធ្វើឱ្យសកម្មនៃអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន។ដើម្បីពិនិត្យមើលសមត្ថភាពចង lncRNA នៃដែននីមួយៗ យើងបានវិស្វកម្មបំរែបំរួលចំនួន 3 ដែលដកចេញនូវដែននីមួយៗនៃ domain ទាំងបី ហើយធ្វើការវិភាគ in vitro RIP ។លទ្ធផលរបស់យើងបានបង្ហាញថាការលុបដែនទីបី (D3) នៃ PACT បានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនូវអន្តរកម្មរបស់វាជាមួយ DARS-AS1 (ដោយ 0.11 ដងធៀបនឹង PACT ដដែល) បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរពីរផ្សេងទៀត (រូបភាព 3h) វាត្រូវបានបង្ហាញថាការចេញផ្សាយ នៃ D3 បានធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ DARS ។-AC1។រួមគ្នា លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថាអន្តរកម្មរវាង DARS-AS1 និង PACT អាចកើតឡើងជាចម្បងតាមរយៈ 3′ ចុងបញ្ចប់នៃ DARS-AS1 និងដែន D3 នៃ PACT ។
យើងបានកត់សម្គាល់ថា DARS-AS1 មិនមានឥទ្ធិពលលើការបញ្ចេញមតិ PACT ហើយ PACT មិនមានឥទ្ធិពលលើ DARS-AS1 (រូបភាពបន្ថែម 3c) ទេ។បន្ទាប់មកយើងពិនិត្យមើលឥទ្ធិពលនៃ PACT ធ្លាក់ចុះលើការលូតលាស់កោសិកា។ផ្ទុយទៅនឹង DARS-AS1 កោសិកាដែលទាក់ទងបានកើនឡើង 1.5-3 ដងលឿនជាងនៅពេលដែល PACT ត្រូវបានទម្លាក់ (រូបភាពបន្ថែម 3d) ។លទ្ធផលនៃការវិភាគលើការបង្កើតអាណានិគមបានបង្ហាញថាកោសិកាបង្កើតអាណានិគម 2-3 ដងបន្ទាប់ពីការព្យាបាល shRNA ជាមួយ PACT (រូបភាពបន្ថែម 3e) ។ដើម្បីសាកល្បងថាតើ DARS-AS1 គ្រប់គ្រងការរីកសាយកោសិកាតាមរយៈ PACT យើងបានបង្កើតកោសិកា SW620 ដែលបង្ហាញលើស PACT, DARS-AS1 ឬទាំងពីរ។ការបង្ហាញហួសកម្រិតនៃ PACT បានបង្ហាញពីការរារាំងយ៉ាងសំខាន់នៃការរីកសាយកោសិកា (រូបភាពទី 3i) ។ខណៈពេលដែល DARS-AS1 overexpression ក្នុងមួយ se បានលើកកម្ពស់ការរីកសាយកោសិកាយ៉ាងសំខាន់ វាមិនមានភាពខុសប្លែកគ្នាខ្លាំងនៅក្នុងអត្រាកំណើននៃកោសិកាដែលបង្ហាញលើស DARS-AS1 និង PACT នោះទេ។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា PACT អាចទប់ទល់នឹងការកើនឡើងដែលបណ្តាលមកពី DARS-AS1 overexpression។
ដោយសារតំបន់ផ្សេងៗគ្នានៃ DARS-AS1 មានសមត្ថភាពភ្ជាប់ PACT ខុសៗគ្នា យើងបានស៊ើបអង្កេតឥទ្ធិពលទាក់ទងរបស់ពួកគេលើការរីកសាយកោសិកាដោយការបង្ហាញពីបំណែក DARS-AS1 ច្រើនពេក។បើប្រៀបធៀបទៅនឹងបំណែកពីរផ្សេងទៀត DARS-AS1 ត្រូវបានបង្ហាញហួសហេតុនៅចុង 3′ (384–768 nt) ដែលជាតំបន់ដែលទាក់ទងនឹង PACT សំខាន់នៅក្នុង DARS-AS1 ដែលមានសមត្ថភាពខ្ពស់បំផុតក្នុងការជំរុញការរីកសាយកោសិកា (រូបភាព 3j) ។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញពីទំនាក់ទំនងវិជ្ជមានរវាងសមត្ថភាពចង និងមុខងារជីវសាស្រ្តរបស់ DARS-AS1។
PACT ត្រូវ​បាន​គេ​រាយការណ៍​ថា​ជា Pro-apoptotic protein19 ។ដូច្នេះហើយ យើងបានស៊ើបអង្កេតពីឥទ្ធិពលនៃ DARS-AS1 ទៅលើជំងឺ apoptosis ។ដូចដែលបានរំពឹងទុក ការទម្លាក់ DARS-AS1 បានបង្កើនការបំបែក PARP យ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងកោសិកា SW620 និងបានបង្កើនសមាមាត្រនៃកោសិកាភ្ជាប់ V-positive នៅក្នុង SW620, HCT116, HepG2 និង MBA-MD-231 កោសិកា (រូបភាព 3k) ។៣).3f–h) បង្ហាញថាឥទ្ធិពលប្រឆាំងនឹង apoptotic នៃ DARS-AS1 នៅក្នុងកោសិកាមហារីកគឺផ្ទុយទៅនឹងមុខងារដែលជំរុញឱ្យ apoptosis នៃ PACT ។រួមគ្នា លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា យន្តការនៃមុខងារ oncogenic របស់ DARS-AS1 អាចតាមរយៈការរារាំងមុខងារ PACT ។
បន្ទាប់មក យើងបានស្វែងយល់ពីផលប៉ះពាល់មុខងារនៃសមាគម DARS-AS1-PACT។PACT ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថានឹងធ្វើឱ្យ PKR សកម្មតាមរយៈអន្តរកម្មដោយផ្ទាល់ ដែលជាបន្តបន្ទាប់ពង្រឹង eIF2α phosphorylation ដែលបណ្តាលឱ្យមានការលុបការបកប្រែ និង apoptosis17 ។ដំបូង យើងបានពិនិត្យថាតើ DARS-AS1 ប៉ះពាល់ដល់ការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មកោសិកានៃ PACT និង PKR ដែរឬទេ។Confocal fluorescence microscopy បានបង្ហាញថា PACT និង PKR ត្រូវបាន colocalized យ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងកោសិកា SW620 ជាមួយនឹងមេគុណទំនាក់ទំនង Pearson ជាមធ្យម 0.72 ។ទន្ទឹមនឹងនេះ ការបង្ហាញហួសហេតុ DARS-AS1 បានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនូវ PACT និង PKR សហមូលដ្ឋាននីយកម្ម (មេគុណទំនាក់ទំនង Pearson មធ្យម 0.61) (រូបភាព 4a) ។ដើម្បីស៊ើបអង្កេតថាតើ DARS-AS1 អាចកែប្រែអន្តរកម្ម PACT-PKR បានទេ យើងបានធ្វើការវិភាគរួមគ្នា (co-immunoprecipitation (co-IP)) ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង PACT នៅក្នុងកោសិកា SW620 lysates ។PKR សម្បូរទៅដោយសារធាតុប្រឆាំង PACT នៅក្នុងកោសិកាគ្រប់គ្រង ខណៈពេលដែលការស្ដារឡើងវិញរបស់ PKR ត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង lysates ពីកោសិកាដែលបង្ហាញលើសទម្ងន់ DARS-AS1 (រូបភាព 4b) ។PACT និង PKR ដែលមានស្លាកបន្សុតត្រូវបានប្រើប្រាស់សម្រាប់ការវិភាគការចងប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង vitro ។ដូច្នោះហើយ អ្នកដែលផ្តល់ DARS-AS1 ប៉ុន្តែគ្មានការគ្រប់គ្រង RNA បានបង្ហាញពីអន្តរកម្ម PACT-PKR (រូបភាព 4c) ។លទ្ធផលទាំងអស់បានបង្ហាញថា DARS-AS1 បានរំខានដល់ការទំនាក់ទំនង PACT និង PKR ។
ការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មរួមគ្នានៃ PACT និង PKR នៅក្នុងកោសិកាគ្រប់គ្រង ឬកោសិកាដែលបង្ហាញលើសទម្ងន់ DARS-AS1 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ fluorescence confocal ។ស្នូលត្រូវបានប្រឡាក់ដោយ DAPI ។លទ្ធផលស្ថិតិទទួលបានពីរូបថតចំនួន 16 ។b Co-immunoprecipitation (co-IP) ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង PACT នៅក្នុងកោសិកា lysates នៃកោសិកាគ្រប់គ្រង SW620 ឬកោសិកាដែលបង្ហាញលើសទម្ងន់ DARS-AS1 ។c ដែលមានស្លាក PACT, បន្សុត PKR និងចម្លងក្នុង vitro ជាមួយ DARS-AS1 ឬ mock RNA ត្រូវបាន incubed សម្រាប់ការវិភាគការចងប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង vitro ។អង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹងទង់ជាតិត្រូវបានប្រើសម្រាប់ immunoprecipitation ។d Immunoblots ជាមួយនឹងអង្គបដិបក្ខដែលបានចង្អុលបង្ហាញត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងកោសិកា SW620 និង HCT116 ដែលឆ្លងដោយការគ្រប់គ្រង shRNA ឬ DARS-AS1-shRNA បន្តដោយការអត់ឃ្លានសេរ៉ូម។e កម្រិតនៃការបញ្ចេញមតិ DARS-AS1 បានផ្លាស់ប្តូរភាពប្រែប្រួលនៃកោសិកាទៅ thapsigargin ។កោសិកា SW620 ត្រូវបានចម្លងជាមួយ DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid ឬ plasmid គ្រប់គ្រង។កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយសារធាតុ thapsigargin រយៈពេល 48 ម៉ោង ហើយលទ្ធភាពជោគជ័យនៃកោសិកាត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើសារធាតុ MTS ។f in vitro transcribed DARS-AS1 ឬអត់ចេះសោះ RNA និង PACT បន្សុត ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគសកម្មភាពនៅក្នុង vitro និងការរកឃើញ immunoblot ។g Immunoblots ដោយប្រើអង្គបដិបក្ខទាំងនេះត្រូវបានអនុវត្តនៅលើកោសិកា SW620-ctrl (ខាងឆ្វេង) ឬកោសិកាដែលបង្ហាញ PKR mutants លើស (ស្តាំ) ។បន្ទាប់មកកោសិកាទាំងនេះត្រូវបានចម្លងដោយការគ្រប់គ្រង shRNA ឬ DARS-AS1-shRNA បន្តដោយការអត់ឃ្លានសេរ៉ូម។h Flow cytometry បានបង្ហាញថាការអសកម្មនៃ PKR mutant បានទូទាត់សងសម្រាប់ apoptosis ដែលបណ្ដាលមកពី DARS-AS1 នៅក្នុងកោសិកា SW620 ។i Immunoblots ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណដែលបានបញ្ជាក់ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងកោសិកា SW620 (ឆ្វេង) ឬ HCT116 (ស្តាំ) ។កោសិកាដែលត្រូវបានចម្លងដោយការគ្រប់គ្រង shRNA ឬ DARS-AS1 shRNA ត្រូវបានដកហូតសេរ៉ូម និងត្រូវបានបន្ថែមដោយ 100 nM PKR C16 inhibitor ឬ DMSO ។របារមាត្រដ្ឋាន = 5 µm ។ទិន្នន័យ​ដែល​បាន​បង្ហាញ​គឺ​ជា​មធ្យម ± គម្លាត​ស្តង់ដារ​នៃ​ការ​ពិសោធន៍​បី។* p ≤ 0.05 two-tailed Student's t-test.
ជាទូទៅគេជឿថានៅពេលដែល PACT ធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ PKR17 នោះ PKR phosphorylation នៅ Thr451 អាចត្រូវបានជំរុញ។លទ្ធផលរបស់យើងបានបង្ហាញថាកម្រិតនៃ PKR phosphorylation ត្រូវបានកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងកោសិកា DARS-AS1 បន្ទាប់ពីការអត់ឃ្លានសេរ៉ូម (រូបភាពទី 4d និងបន្ថែមរូបភាព 4a) ។ដូច្នោះហើយ យើងបានរកឃើញថា phosphorylation នៃ eIF2α ដែលជាស្រទាប់ខាងក្រោម PKR សំខាន់ក៏ត្រូវបានកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងផងដែរដោយ DARS-AS1 shRNA (រូបភាពទី 4d និងបន្ថែមរូបភាព 4a) ។Thapsigargin គឺជាភាពតានតឹង ER ដែលបណ្តាលឱ្យ ER បញ្ចេញ Ca2+ ។ការព្យាបាលជាមួយ thapsigargin ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថាជំរុញឱ្យមានការបញ្ចេញមតិ និងការធ្វើឱ្យសកម្មនៃ PACT ដែលមានអន្តរកម្មបន្ថែមទៀតជាមួយនិងធ្វើឱ្យ PKR សកម្មដែលនាំឱ្យ apoptosis ដោយបង្កើន eIF2α phosphorylation 18,61 ។នៅទីនេះ យើងបានប្រើ thapsigargin ជាអ្នករំញោចនៃផ្លូវ PACT/PKR ដើម្បីស៊ើបអង្កេតថាតើ DARS-AS1 អាចជួយកោសិកាយកឈ្នះលើភាពតានតឹងដោយរារាំងផ្លូវ PACT/PKR ដែរឬទេ។យើងបានសង្កេតឃើញថាកម្រិតនៃការបញ្ចេញមតិ DARS-AS1 មានទំនាក់ទំនងជាវិជ្ជមានជាមួយនឹងភាពធន់នៃកោសិកាទៅនឹង thapsigargin ។កោសិកា SW620 ដែលបង្ហាញលើសទម្ងន់ DARS-AS1 បានរស់រានមានជីវិតប្រសើរជាងមុននៅពេលព្យាបាលដោយ thapsigargin ខណៈពេលដែលកោសិកាដែលមានការគោះ DARS-AS1 កាន់តែងាយនឹងកើតមាន (រូបភាព 4e) ។ស្របជាមួយនឹងលទ្ធផលទាំងនេះ ការបង្ហាញហួសហេតុ DARS-AS1 បានកាត់បន្ថយ phosphorylation PKR ដែលបង្កដោយ thapsigargin (រូបភាពបន្ថែម 4b) ។ផ្ទុយទៅវិញ បន្ទាប់ពីការព្យាបាល thapsigargin PKR និង eIF2α ត្រូវបាន phosphorylated ក្នុងកម្រិតខ្ពស់ជាងនៅក្នុងកោសិកា DARS-AS1 ដែលធ្លាក់ចុះបើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាគ្រប់គ្រង (រូបភាពបន្ថែម 4b) ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ថា thapsigargin បានជំរុញការបញ្ចេញមតិ DARS-AS1 ក្នុងលក្ខណៈអាស្រ័យលើកម្រិតថ្នាំ ដែលអាចបង្ហាញពីមុខងារប្រឆាំងនឹងភាពតានតឹងរបស់ DARS-AS1 (រូបភាពបន្ថែម 4c) ។លើសពីនេះ យើងបានធ្វើការវិភាគសកម្មភាពនៅក្នុង vitro ដើម្បីបញ្ជាក់ពីការសង្កេតទាំងនេះ។ដោយសង្ខេប PKR ត្រូវបានបន្សុតចេញពីកោសិកា lysates ដោយប្រើអង់ទីករប្រឆាំង PKR បន្ទាប់មក incubated ជាមួយ recombinant PACT និង DARS-AS1 ចម្លងក្នុង vitro ។បន្ទាប់ពីប្រតិកម្មអង់ស៊ីម phospho-PKR ត្រូវបានរកឃើញដោយប្រើ WB ។លទ្ធផលរបស់យើងបានបង្ហាញថា PKR phosphorylation ត្រូវបានរារាំងយ៉ាងខ្លាំងដោយ DARS-AS1 ប៉ុន្តែមិនមែនដោយការគ្រប់គ្រង RNA (រូបភាពទី 4f) នោះទេ។លទ្ធផលទាំងនេះនៅក្នុង vitro និង in vivo បង្ហាញថា DARS-AS1 រារាំងការធ្វើឱ្យសកម្ម PKR ដែលសម្របសម្រួលដោយ PACT ។ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ យើងក៏បានសង្កេតឃើញការថយចុះនៃការស្តារ PACT នៅក្នុងវត្តមាននៃ DARS-AS1 (រូបភាពទី 4f) ។លទ្ធផលនេះគឺស្របជាមួយនឹងលទ្ធផលនៃការវិភាគការចងប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង vitro (រូបភាពទី 4c) ហើយម្តងទៀតបង្ហាញពីមុខងារទប់ស្កាត់ DARS-AS1 សម្រាប់សមាគម PACT-PKR ។
Ser246 និង Ser287 នៅក្នុងដែន D3 នៃ PACT ត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការធ្វើឱ្យសកម្ម PKR ក្រោមភាពតានតឹងកោសិកា។ការជំនួសសំណល់សេរីនចំនួនពីរសម្រាប់អាឡានីនបានផ្តល់ឱ្យ mutant PACT (mutD) ដែលបានធ្វើឱ្យ PKR សកម្មនៅពេលអវត្តមាននៃភាពតានតឹង ហើយការជំនួសសម្រាប់ alanine (mutA) បានបញ្ច្រាសពិធីការ។ដោយសារយើងបានបង្ហាញអំពីសារៈសំខាន់នៃដែននេះក្នុងការផ្សារភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ជាមួយ DARS-AS1 យើងបានបង្កើត PACT mutants ទាំងពីរនេះ ដើម្បីសាកល្បងថាតើសំណល់ទាំងនេះក៏អាចពាក់ព័ន្ធនឹងអន្តរកម្មជាមួយ DARS-AS1 ផងដែរ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ អ្នកផ្លាស់ប្តូរទាំងពីរបានបាត់បង់សមត្ថភាពក្នុងការចងជាមួយ DARS-AS1 (រូបភាពបន្ថែម 4d) ដែលបង្ហាញថារចនាសម្ព័ន្ធពេញលេញនៃប្រូតេអ៊ីន PACT អាចត្រូវបានទាមទារសម្រាប់អន្តរកម្មប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពជាមួយ DARS-AS1 ។
លើសពីនេះ លទ្ធផលរបស់យើងក៏បង្ហាញផងដែរថា ការរារាំងដែលបណ្ដាលមកពី DARS-AS1-shRNA នៃការរីកសាយកោសិកាអាចត្រូវបានស្ដារឡើងវិញដោយផ្នែកដោយការបញ្ចេញសារធាតុ PACT អវិជ្ជមានលើសលុប (PACTmutA) ឬ PKR mutant អវិជ្ជមាន (PKRmut) (បំពេញបន្ថែមរូបភាព 4e. e) ។ការបង្ហាញហួសហេតុនៃសារធាតុបំប្លែង PKR អវិជ្ជមានបានកាត់បន្ថយ PKR phosphorylation ដែលបង្កឡើងដោយការគោះ DARS-AS1 ក៏ដូចជា eIF2α phosphorylation នៅក្នុងកោសិកាដែលខ្វះសេរ៉ូម (រូបភាព 4g) ។សំខាន់ជាងនេះទៅទៀត សមាមាត្រនៃកោសិកា apoptotic ដែលបង្កឡើងដោយការគោះ DARS-AS1 ក៏ត្រូវបានកាត់បន្ថយផងដែរនៅក្នុងកោសិកាដែលបង្ហាញ PKRmut ច្រើនពេក (រូបភាព 4h និងរូបភាពបន្ថែម 4g) ។ការទប់ស្កាត់សកម្មភាព PKR kinase ក៏ធ្វើឱ្យខូចមុខងារ DARS-AS1 ផងដែរ ព្រោះលទ្ធផលបានបង្ហាញថា ការធ្លាក់ DARS-AS1 កម្របង្កឱ្យមាន PKR និង eIF2α phosphorylation នៅពេលដែលកោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ PKR-specific C16 inhibitor (រូបភាព 4i និងបន្ថែម រូប 4h) ។)សរុបមក លទ្ធផលរបស់យើងបានបង្ហាញថា DARS-AS1 ជំរុញការរីកសាយកោសិកា យ៉ាងហោចណាស់មួយផ្នែកដោយការរារាំងសកម្មភាព PACT-mediated PKR ។
ដើម្បីស្វែងយល់បន្ថែមអំពីតួនាទីរបស់ DARS-AS1 ក្នុងដុំសាច់ យើងបានធ្វើការពិសោធន៍ vivo ដោយប្រើគំរូ mouse xenograft ។ លទ្ធផលបង្ហាញថាការទម្លាក់ DARS-AS1 ថយចុះយ៉ាងខ្លាំងនូវការលូតលាស់ដុំសាច់ក្នុងសត្វកណ្តុរ (តម្លៃ p < 0.0001) (រូបភាព 5a)។ លទ្ធផលបង្ហាញថាការទម្លាក់ DARS-AS1 ថយចុះយ៉ាងខ្លាំងនូវការលូតលាស់ដុំសាច់ក្នុងសត្វកណ្តុរ (តម្លៃ p < 0.0001) (រូបភាព 5a)។ Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. លទ្ធផលបង្ហាញថា DARS-AS1 ធ្លាក់ចុះយ៉ាងខ្លាំងកាត់បន្ថយការលូតលាស់ដុំសាច់ក្នុងសត្វកណ្តុរ (p value < 0.0001) (រូបភាព 5a)។结果表明，DARS-AS1的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）។结果表明，DARS-AS1的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001)（图5a）។ Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001). (5,0001). លទ្ធផលបានបង្ហាញថាការធ្លាក់ DARS-AS1 បានកាត់បន្ថយការលូតលាស់ដុំសាច់ក្នុងសត្វកណ្តុរយ៉ាងខ្លាំង (តម្លៃ p < 0.0001) (រូបភាពទី 5 ក)។ដូច្នេះនៅក្នុងក្រុម DARS-AS1 មានការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃបរិមាណដុំសាច់ជាមធ្យមប្រហែល 72.9% និងមធ្យមដុំសាច់ប្រហែល 87.8% (រូបភាព 5b-d) ។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញយ៉ាងខ្លាំងថា DARS-AS1 អាចជំរុញការលូតលាស់ដុំសាច់នៅក្នុង vivo យ៉ាងខ្លាំង។
ផលប៉ះពាល់នៃការបិទផ្សាយពាណិជ្ជកម្ម DARS-AS1 លើការកើតមហារីកពោះវៀនធំនៅក្នុងសត្វកណ្តុរអាក្រាតកាយ។ខ្សែកោងកំណើន (ក) ទំហំដុំសាច់ (ខ) ទម្ងន់ (គ) និងរូបភាពដុំសាច់ (ឃ) ត្រូវបានបង្ហាញ។របារកំហុសតំណាងឱ្យ±SEM។ n = 10. ****p < 0.0001 ដោយការសាកល្បង t របស់សិស្សដែលមានកន្ទុយពីរ។ n = 10. ****p < 0.0001 ដោយការសាកល្បង t របស់សិស្សដែលមានកន្ទុយពីរ។ n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента ។ n = 10. ****p < 0.0001 two-tailed Student's t-test.n = ១០. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验។ ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验។ ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента ។ ****p < 0.0001 two-tailed Student's t-test ។e Kaplan-Meier បានវិភាគទំនាក់ទំនងរវាងកម្រិតនៃការបញ្ចេញមតិ DARS-AS1 និងការរស់រានមានជីវិតជាទូទៅចំពោះអ្នកជំងឺដែលមាន UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM និង LGG ។កម្រិតខ្ពស់នៃការបញ្ចេញមតិ DARS-AS1 ចំពោះអ្នកជំងឺគឺស្ថិតនៅក្នុងកំពូល 50%;កម្រិតទាបនៃការបញ្ចេញមតិ DARS-AS1 ចំពោះអ្នកជំងឺគឺនៅខាងក្រោម 50% ។p-values ​​ត្រូវ​បាន​កំណត់​ដោយ​ប្រើ​ការ​ធ្វើ​តេ​ស្ត​ចំណាត់​ថ្នាក់​កំណត់​ហេតុ។f គំរូដែលបានស្នើឡើងដែល DARS-AS1 គ្រប់គ្រងផ្លូវ PACT-PKR និងការលូតលាស់ដុំសាច់។
ដើម្បីយល់កាន់តែច្បាស់ពីផលប៉ះពាល់ខាងគ្លីនិកនៃ DARS-AS1 យើងបានពិនិត្យទំនាក់ទំនងរវាងការបង្ហាញរបស់វា និងការរស់រានមានជីវិតរបស់អ្នកជំងឺ។តាមរយៈការវិភាគសំណុំទិន្នន័យ TCGA យើងបានរកឃើញថាកន្សោម DARS-AS1 ខ្ពស់ជាងនេះត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងជំងឺមហារីកស្បែកប្រភេទ uveal (UVM), ក្រូម៉ូសូមនៃតំរងនោម (KICH), មហារីកកោសិកានៃកោសិកា papillary (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex ។ការរស់រានមានជីវិតទាបត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់យ៉ាងខ្លាំងជាមួយនឹង glioblastoma morphosis (GBM) និងអ្នកជំងឺដែលមានកម្រិតទាបនៃខួរក្បាល glioma (LGG) (រូបភាព 5e) ។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា DARS-AS1 អាចដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការវិវត្តនៃដុំសាច់មហារីក ហើយអាចជា biomarker ដែលអាចទស្សន៍ទាយបាននៅក្នុងមហារីកជាច្រើន។
នៅក្នុងការសិក្សានេះ ដោយប្រើការត្រួតពិនិត្យមុខងារ CRISPRi ខ្នាតធំ យើងបានកំណត់ថា DARS-AS1 lncRNA យកឈ្នះភាពតានតឹងកោសិកាមហារីកដោយគ្រប់គ្រងការឆ្លើយតបស្ត្រេសសំខាន់ៗពីរគឺ PACT និង PKR ។តាមរយៈការធ្វើអន្តរកម្មដោយផ្ទាល់ជាមួយ PACT, DARS-AS1 បានរារាំងការធ្វើឱ្យសកម្ម PACT-សម្របសម្រួល PKR ដោយហេតុនេះការពារការស្លាប់កោសិកា apoptotic និងលើកកម្ពស់ការរីកសាយកោសិកា (រូបភាព 5f) ។ការដាក់កម្រិតនៃ DARS-AS1 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងប្រភេទមហារីកជាច្រើន ដែលបង្ហាញថាមុខងាររបស់វាក្នុងការលើកកម្ពស់ការរស់រានមានជីវិតរបស់កោសិកាមហារីកក្រោមលក្ខខណ្ឌតានតឹងអាចត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងទូលំទូលាយចំពោះប្រភេទមហារីកជាច្រើន។
PACT ត្រូវបានកំណត់ថាជាប្រូតេអ៊ីនសកម្ម PKR ហើយការធ្វើឱ្យសកម្ម PKR ដែលសម្របសម្រួលដោយ PACT ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការឆ្លើយតបស្ត្រេស ដោយធ្វើនិយតកម្មការចម្លង ការបកប្រែ ការ apoptosis និងដំណើរការកោសិកាសំខាន់ៗផ្សេងទៀត62។អស់ជាច្រើនទសវត្សរ៍មកហើយ ការប៉ុនប៉ងត្រូវបានធ្វើឡើងដើម្បីស្វែងយល់អំពីបទប្បញ្ញត្តិជាក់លាក់នៃជំងឺមហារីកនៃ PACT-PKR cascade ។នៅទីនេះ ការសិក្សារបស់យើងបានបង្ហាញពីយន្តការផ្សេងគ្នានៃបទប្បញ្ញត្តិនៃ PACT-PKR នៅក្នុងកោសិកាមហារីកតាមរយៈកោសិកា LncRNA DARS-AS1 ដែលភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅនឹង PACT រារាំងអន្តរកម្ម PACT-PKR រារាំងការធ្វើឱ្យសកម្ម PKR និង eIF2α phosphorylation ដោយហេតុនេះរារាំង apoptosis ដែលបណ្តាលមកពីភាពតានតឹង និង ជំរុញការរីកសាយនៃជំងឺមហារីកជាយថាហេតុ។កោសិកា។របកគំហើញនេះបង្ហាញពន្លឺលើគោលដៅសក្តានុពល lncRNA សម្រាប់ការព្យាករណ៍ និងការព្យាបាលជំងឺមហារីក។
ទិន្នន័យរបស់យើងបានបង្ហាញថាការធ្លាក់ DARS-AS1 រំញោចកោសិកាទៅនឹងភាពអត់ឃ្លាននៃសេរ៉ូមជាមួយនឹងការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃសារធាតុ phosphorylated PKR និង eIF2α។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា DARS-AS1 លើកកម្ពស់ការរស់រានមានជីវិតរបស់កោសិកាមហារីកក្រោមលក្ខខណ្ឌដ៏អាក្រក់ដោយរារាំងសកម្មភាព PACT/PKR ។RNAs ដែលមិនសរសេរកូដមួយចំនួនផ្សេងទៀត ដូចជា ASPACT និង nc886 ក៏ជាប់ពាក់ព័ន្ធនៅក្នុងអ័ក្ស PACT/PKR ផងដែរ ដោយកំណត់ PACT48 mRNA ឬគ្រប់គ្រង autophosphorylation ដោយចងភ្ជាប់ជាមួយ PKR49,50,64។ក្នុងចំណោមពួកគេ DARS-AS1 ដើរតួជាអ្នករំខានដល់សមាគម PACT-PKR ។ការសិក្សានេះបង្កើនការយល់ដឹងរបស់យើងអំពីបទប្បញ្ញត្តិអ័ក្ស PACT/PKR និងតួនាទីរបស់ lncRNAs ក្នុងការឆ្លើយតបស្ត្រេស។
PACT មានដែនបីដាច់ដោយឡែកពីគ្នា។នីមួយៗនៃ dsRBDs ពីរដំបូងគឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីសម្រេចបាននូវការផ្សារភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងខ្ពស់នៃ PACT ទៅ PKR ខណៈដែលដែនទីបី (D3) ត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការធ្វើឱ្យសកម្ម PKR នៅក្នុង vitro និង in vivo ។ការសិក្សារបស់យើងបានបង្ហាញថា DARS-AS1 មានអន្តរកម្មជាអាទិភាពជាមួយដែន D3 (រូបភាព 3h)។ដោយសារទំហំធំនៃ lncRNA (768 nucleotides) ការភ្ជាប់ DARS-AS1 ទៅ D3 អាចរារាំងរាងកាយអន្តរកម្មរវាងដែន PACT នៃ dsRBD និង PKR ដោយហេតុនេះរារាំងការផ្សារភ្ជាប់គ្នានៃ PACT និង PKR ។ការផ្លាស់ប្តូរចំណុច PACT ដែលជំនួស Ser246 និង Ser287 នៅក្នុង D3 ជាមួយ alanine ឬ aspartate បានរំខានដល់ទំនាក់ទំនងនៃការចងរបស់វាសម្រាប់ DARS-AS1 ដោយចង្អុលទៅសារៈសំខាន់នៃរចនាសម្ព័ន្ធ និងលក្ខណៈអគ្គិសនីរួមរបស់ D3 នៅក្នុងសមាគមរបស់ពួកគេ។ព័ត៌មានលម្អិតបន្ថែមនៃយន្តការនេះនឹងត្រូវបានទាមទារនាពេលអនាគត ដោយប្រើការវិភាគជីវគីមីកាន់តែច្បាស់លាស់ និងការវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធ PACT ដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់។
ការសិក្សាពីមុនបានរាយការណ៍ថា DARS-AS1 ជំរុញការរីកសាយកោសិកាតាមរយៈយន្តការជាច្រើន 51,52,53។ក្នុងឧទាហរណ៍មួយ អ្នកស៊ើបអង្កេតបានសង្កេតឃើញថា DARS-AS1 បានធ្វើការគ្រប់គ្រងហ្សែន DARS ប្រូតេអ៊ីនប្រឆាំងនឹងមេរោគដោយកំណត់គោលដៅ miP-194-5p នៅក្នុងកោសិកាមហារីកតម្រងនោម។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅក្នុងការសិក្សាបច្ចុប្បន្ន ការទម្លាក់ DARS-AS1 មានឥទ្ធិពលតិចតួចលើការចម្លង DARS នៅក្នុងប្រភេទមហារីកជាច្រើន រួមទាំងមហារីកពោះវៀនធំ សុដន់ និងថ្លើមយ៉ាងតិច។ដោយសារតែ lncRNAs បង្ហាញគំរូនៃការបញ្ចេញមតិជាក់លាក់នៃកោសិកា និងជាលិកា យន្តការមុខងារអាចមិនត្រូវបានរក្សាទុកនៅទូទាំងប្រភេទមហារីក ដែលអាចរួមចំណែកដល់ភាពខុសគ្នារវាងការសង្កេតរបស់យើង និងការវាយតម្លៃពីមុននៃជំងឺមហារីកផ្សេងៗគ្នា។ការសិក្សាពិសេសគឺត្រូវការជាចាំបាច់ដើម្បីបំភ្លឺអំពីយន្តការជាក់លាក់នៃដំណើរការសរីរវិទ្យា និងរោគសាស្ត្រផ្សេងៗ។
ការវិភាគលើទិន្នន័យគ្លីនិកបានបង្ហាញថា ការបង្ហាញ DARS-AS1 នៅក្នុងដុំសាច់មានទំនាក់ទំនងផ្ទុយគ្នាជាមួយនឹងការរស់រានមានជីវិតរបស់អ្នកជំងឺមហារីក ដែលគូសបញ្ជាក់ពីសារៈសំខាន់នៃអ័ក្ស DARS-AS1/PACT/PKR ក្នុងការព្យាករណ៍ជំងឺមហារីក។សរុបសេចក្តី ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញថា DARS-AS1 គឺជានិយតករនៃអ័ក្សផ្តល់សញ្ញា PACT/PKR ជំរុញការរីកសាយកោសិកាមហារីក និងរារាំង apoptosis កំឡុងពេលឆ្លើយតបស្ត្រេស ដែលផ្តល់នូវការស្រាវជ្រាវមួយផ្សេងទៀត និងជាចំណាប់អារម្មណ៍សម្រាប់ការស្រាវជ្រាវនាពេលអនាគតចំពោះការព្យាបាលសក្តានុពល។ .
ខ្សែកោសិកាមនុស្ស SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 និង HEK293T ត្រូវបានទទួលពីហេដ្ឋារចនាសម្ព័ន្ធធនធានខ្សែជាតិក្នុងប្រទេសចិន។កោសិកាទាំងអស់ត្រូវបានរក្សានៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) បន្ថែមដោយ 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) និង 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) នៅសីតុណ្ហភាព 37°C, 5% CO2 ។កន្លែងភ្ញាស់។
ប្រឆាំង PACT, Abcam (ab31967);ប្រឆាំង PKR, Abcam (ab184257);ប្រឆាំង PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);ប្រឆាំងទង់ជាតិ Abcam (ab125243);ប្រឆាំង eIF2α, Abcam (A0764));ប្រឆាំងនឹង eIF2α (ផូស្វ័រ S51), Abcam (ab32157);ប្រឆាំង PACT (ផូស្វ័រ S246), Abgent (AP7744b);ប្រឆាំងនឹងβ-tubulin, CST (2128);កណ្ដុរធម្មតា IgG, CST (5415S);ទន្សាយធម្មតា IgG, CST (2729S) ។អង្គបដិប្រាណត្រូវបានពនឺ 1:1000 ក្នុង PBST សម្រាប់ការលាបពណ៌បស្ចិមប្រទេស និង 1:100 សម្រាប់ IP ។
sgRNAs ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយប្រើឧបករណ៍ដែលមានជាសាធារណៈហៅថា CRISPR-ERA66។យើងបានប្រើប៉ារ៉ាម៉ែត្រឧបករណ៍លំនាំដើមសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍន៍ sgRNA និងក្បួនដោះស្រាយដែលបានគណនាគេហទំព័រចង sgRNA នៅក្នុងតំបន់ 3 kb ។ផ្តោតលើ TSS ។បណ្តុំនៃ sgRNA oligonucleotides ត្រូវបានសំយោគនៅ CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ហើយបានក្លូនទៅជា pgRNA plasmids ដែលមានលក្ខណៈមនុស្សជាតិ (Addgene #44248)។សរុប 12 µg នៃ pgRNA plasmid របស់មនុស្សដែលរួមបញ្ចូលគ្នា, 7.2 µg នៃ psPAX2 (Addgene #12260) និង 4.8 µg នៃ pMD2.G (Addgene #12259) ត្រូវបានចម្លងចូលទៅក្នុងចានទំហំ 5 x 106 HEK293T ក្នុង 10 Transfection DNA ។ កោសិកា (CWBIO, ប៉េកាំង, ចិន) តាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ពពួកអតិសុខុមប្រាណដែលមានផ្ទុកមេរោគត្រូវបានប្រមូលក្នុងរយៈពេល 48 និង 72 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការចម្លង និងត្រងតាមរយៈតម្រង 0.45 µm ។សម្រាប់ការពិនិត្យ កោសិកា SW620 ដែលបង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីន dCas9/KRAB fusion ត្រូវបានទទួលដោយការចម្លងមេរោគ។កោសិកា SW620 ដែលបានកែប្រែត្រូវបានឆ្លងមេរោគជាមួយបណ្ណាល័យមេរោគនៅក្នុងការពិសោធន៍ឆ្លងឯករាជ្យចំនួនបួននៅ MOI នៃ 0.1-0.3 ហើយត្រូវបានគេយកសំណាកដោយ 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) រយៈពេល 2 ថ្ងៃ។បន្ទាប់មក កោសិកាត្រូវបានដាំដុះរយៈពេល 18 ថ្ងៃនៅក្នុង vitro ជាមួយនឹងបណ្ណាល័យអប្បបរមា 500 កោសិកា/sgRNA សម្រាប់ការពិនិត្យ។
DNA ហ្សែនត្រូវបានស្រង់ចេញតាមការណែនាំរបស់ QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183)។សរុបមក 100 μg នៃ DNA ហ្សែនក្នុងមួយជីវសាស្រ្តឡើងវិញ ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតបណ្ណាល័យ។តំបន់ sgRNA ត្រូវបានពង្រីកដោយ PCR ពីរជុំ និងភ្ជាប់ទៅបាកូដ។
ផលិតផល PCR ត្រូវបានបន្សុតដោយប្រើប្រាស់ NucleoSpin® gel និង PCR purification kit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) និងកំណត់បរិមាណដោយប្រើ Qubit™ HS double-stranded DNA detection Kit (Thermo Fisher Scientific; Q32854)។
ការវិភាគ MTS ត្រូវបានប្រើដើម្បីវាស់ស្ទង់ការរីកសាយកោសិកា។កោសិកា​ត្រូវ​បាន​បណ្ដុះ​នៅ​ក្នុង​ចាន​អណ្តូង 96 នៅ​ដង់ស៊ីតេ​ដំបូង​នៃ 2000 កោសិកា/អណ្តូង។ចំនួនកោសិកាដែលទាក់ទងត្រូវបានវាស់ជារៀងរាល់ថ្ងៃតាមពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញសម្រាប់រយៈពេលសរុប 4-6 ថ្ងៃ។សម្រាប់អណ្តូងនីមួយៗ 20 μlនៃសារធាតុ MTS (Promega) ត្រូវបានពនឺជាមួយ 100 μl នៃ DMEM, incubated ជាមួយកោសិការយៈពេល 4 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ° C ហើយបន្ទាប់មក OD490 ត្រូវបានវាស់។
សមត្ថភាព​សម្រាប់​កំណើន​ដែល​មិន​បាន​បោះ​បង់​ត្រូវ​បាន​រក​ឃើញ​ដោយ​ការ​វិភាគ​លើ​ការ​បង្កើត​រាង​ស្វ៊ែរ។ដោយសង្ខេប កោសិកាចំនួន 2000 ដែលត្រូវបានចម្លងជាមួយ shRNA DARS-AS1 ឬ shRNA ត្រួតពិនិត្យត្រូវបានបង្កាត់នៅក្នុងមីក្រូប្លាតភ្ជាប់ទាបបំផុត (Corning) ជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរមធ្យមរៀងរាល់ 4 ថ្ងៃម្តង។Spheroids ត្រូវបានរាប់បន្ទាប់ពី 14 ថ្ងៃ។កោសិកាចំនួន 500 ដែលត្រូវបានចម្លងជាមួយ DARS-AS1 plasmid overexpression plasmid ឬ plasmid វត្ថុបញ្ជាត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង បើមិនដូច្នេះទេ វិធីសាស្ត្រនេះមិនផ្លាស់ប្តូរទេ។
RNA ត្រូវបានចម្លងដោយប្រើ T7 RNA polymerase និង biotin-16-UTP (Roche 1138908910) យោងតាមការណែនាំរបស់ Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) ។ថ្នាំ primers ដែលប្រើនៅទីនេះត្រូវបានរាយក្នុងតារាងបន្ថែម 4 ។
តំបន់ PACT ឬ PKR ដែលសរសេរកូដប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានក្លូនទៅជា pET15b (Addgene #73619) និងបំប្លែងទៅជា BL21(DE3)។បាក់តេរីត្រូវបាន incubated ពេញមួយយប់នៅក្នុង LB ដែលផ្គត់ផ្គង់ជាមួយ ampicillin ហើយបន្ទាប់មកពនឺ 100 ដងជាមួយនឹង LB ស្រស់។នៅពេលដែល OD600 នៃឧបករណ៍ផ្ទុកឈានដល់ 0.8, 1 mM IPTG ត្រូវបានបន្ថែមដើម្បីជំរុញការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីន។បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់ពេញមួយយប់ជាមួយនឹងការញ័រថ្នមៗ (250 rpm នៅ 20°C) គ្រាប់កោសិកាត្រូវបានប្រមូលដោយ centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4°C)។ផ្អាកកោសិកាកោសិកាឡើងវិញក្នុង lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) និង incubate on ice for 30 min, then sonicate (15 min, 5 s on/off, on ice) និង centrifuge (13,000 rpm) ។30 នាទី 4°C)។បន្ទាប់មក សារធាតុ supernatant ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុង Ni-NTA resin (QIAGEN) 3 ដងនៅសីតុណ្ហភាព 4 °C លាង 4 ដងជាមួយនឹង wash buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) និង eluted 3 ដងដោយសរុប។ នៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន 10 មីលីលីត្រ (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole) ។ប្រូតេអ៊ីនដែលបានបន្សុតត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើ WB ហើយកំហាប់ត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើឧបករណ៍វិភាគប្រូតេអ៊ីន Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) ។
ការវិភាគ RIP ត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន ដោយមានការកែប្រែ។ដោយសង្ខេប 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) ស្រាក្រឡុក lyses 7 x 10 ។ (Roche, 1 mM DTT) និង centrifuge នៅ 13,000 rpm សម្រាប់ 15 នាទីនៅ 4 ° C ។បន្ទាប់មក កំពូលអង្គធាតុរាវត្រូវបាន incubated ជាមួយប្រូតេអ៊ីន A+G magnetic beads (Millipore) conjugated with 5 μg of anti-PACT antibody (Abeam) ឬ IgG (CST) ។អង្កាំត្រូវបានលាងសម្អាត 5 ដងជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្ន 5x RIP បន្ទាប់មករំលាយជាមួយប្រូតេអ៊ីន K (NEB) ។RNA ត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយ Trizol និងកំណត់ដោយ RT-qPCR ។ថ្នាំ primers ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងតារាងបន្ថែម 5 ។
ការធ្វើតេស្ត RIP នៅក្នុង vitro ត្រូវបានអនុវត្តតាមពិធីការតេស្ត RIP ស្តង់ដារដែលបានកែប្រែ។សរុបចំនួន 5 pmol នៃ RNA ដែលបានចម្លងនៅក្នុង vitro ត្រូវបានពនឺ 1x ជាមួយ RIP buffer ហើយត្រូវបានរំសាយដោយការ incubation នៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 5 នាទី បន្ទាប់មកដោយភាពត្រជាក់យឺតដល់សីតុណ្ហភាពបន្ទប់។សរុបចំនួន 5 pmol នៃប្រូតេអ៊ីន PACT ដែលមានស្លាកទង់ជាតិនៅដដែល ឬផ្លាស់ប្តូរត្រូវបានបន្សុតពី E. coli ។ភ្ញាស់ជាមួយ RNA ដែលត្រូវបានកែច្នៃឡើងវិញរយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ហើយអនុវត្តតាមនីតិវិធីខាងលើសម្រាប់ការវិភាគ RIP សម្រាប់ IP ប្រឆាំងនឹងទង់ជាតិ។
សម្រាប់ការវិភាគផ្នែកបន្ថែម RNA កោសិកា 1 × 107 ត្រូវបាន lysed ជាមួយ 1xRIP buffer ។បន្ទាប់ពីការ centrifugation នៅ 13,000 rpm សម្រាប់ 15 នាទីនៅ 4 ° C, supernatant ត្រូវបាន pretreated ជាមួយ 30 μlនៃ streptavidin magnetic beads (Beckman) សម្រាប់ 2 ម៉ោងនៅ 4 ° C ។បន្ទាប់មក lysate បន្សុតត្រូវបានផ្គត់ផ្គង់ជាមួយ tRNA yeast និង incubated ជាមួយ 40 pmol នៃ RNA reatured មួយយប់នៅ 4°C បន្ទាប់មកសម្រាប់រយៈពេល 2 ម៉ោងទៀត និង 20 μlនៃ streptavidin magnetic beads ថ្មីដែលត្រូវបានរារាំងដោយ BSA ត្រូវបានបន្ថែម។ជំហានលាងសម្អាតមាន 4 ដងជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្ន 5x RIP និង 4 ដងជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្ន RIP 1x ។ប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវគ្នាត្រូវបាន eluted ជាមួយ biotin elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) និងបំបែកនៅលើ NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) ។បន្ទាប់ពីស្នាមប្រឡាក់ប្រាក់ (Beyotime Biotechnology) ក្រុមតន្រ្តីមួយចំនួនត្រូវបានដកចេញ និងវិភាគដោយ MS ។
ការវិភាគសហ IP ត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីសាកល្បងអន្តរកម្មរវាង PACT និង PKR ។ដោយសង្ខេប លីសេតលើសលប់ត្រូវបានរៀបចំដោយការភ្ញាស់កោសិកា 1 x 107 ក្នុង 1 x RIP buffer អមដោយការ centrifugation នៅ 13,000 rpm រយៈពេល 15 នាទីនៅ 4°C ។Lysates ត្រូវបានផ្ទុកដោយប្រូតេអ៊ីន A + G មេដែកដែលភ្ជាប់ជាមួយ 5 µg នៃអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង PACT និងបង្វិលថ្នមៗពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4 ° C ។អង្កាំត្រូវបានលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្ន 5 × RIP ពីរដងជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្ន 1 × RIP និងត្រូវបានច្រានចោលដោយ 1 × SDS buffer ។ប្រូតេអ៊ីនដែលបានយកមកវិញត្រូវបានវិភាគដោយ SDS-PAGE gel និងរកឃើញដោយ WB ។
2 pmol នៃ PACT ដែលមានទង់ជាតិ និង 1 pmol នៃ PKR ត្រូវបានបន្សុតពី E. coli ។ពនលាយក្នុង 1 × RIP buffer និង incubate ជាមួយ 10 pmol នៃ RNA reatured រយៈពេល 2 ម៉ោងនៅ 4 °C។បន្ទាប់ពីនោះ ពួកគេត្រូវបាន incubated ជាមួយប្រូតេអ៊ីន A+G magnetic bead-conjugated anti-labeled antibody សម្រាប់រយៈពេលពីរម៉ោងបន្ថែម។បន្ទាប់មកអង្កាំត្រូវបានលាងសម្អាត 4 ដងជាមួយនឹង 1x RIP buffer និង eluted ជាមួយ 1x SDS buffer។លទ្ធផល PACT និង PKR ត្រូវបានរកឃើញដោយ WB ។